[發明專利]檢測分枝桿菌感染的試劑、方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201110315979.8
• 申請日: 2011-10-18
• 公開（公告）號: CN103063836A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 張文宏;陳嘉臻;沈瑤杰;邵凌云;王森;張穎;翁心華
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

技術領域

本發明屬于生物醫學檢驗領域，涉及一種微生物分子生物學檢測方法，尤其涉及檢測結核感染的試劑、方法和試劑盒。

背景技術

結核病是當今一個主要的公共健康問題，它的病原體是結核桿菌，屬于分枝桿菌屬。全世界每年大約有800-1000萬新發結核病例，每年有200-300萬人因此而失去生命，結核病是引起成年人死亡的頭號傳染病。據WHO報道，全球三分之一的人口（約20億）已感染了結核桿菌，如不采取措施，近10年內還將有約3億人受結核桿菌感染。據第四次全國流行病學調查顯示，我國受結核桿菌感染人數超過4億，每年有13萬人死于結核病，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二。

在全面實施DOTS（直接督導治療）策略后，中國的結核發病率并沒有如預期地出現下降，這與潛在的大量未被診斷的潛伏感染以及痰菌陰性結核病人未被及時診斷有關，這些感染者是一個巨大的結核病源庫，DOTS計劃只能針對發病的肺結核患者，而對于消滅潛伏感染的病人或者痰菌陰性的癥狀不典型的患者沒有貢獻?，F在，發達國家已經充分注意到這一現象，在7年前甚至更早已經啟動對潛伏感染患者的干預。全球結核控制的一項策略是在高危人群中實施有效的篩查計劃，這樣可以鑒別出那些有潛伏感染的病人，通過治療他們來預防結核。而其中最突出的問題是如何準確迅速地發現潛伏感染者和高危人群并加以控制。

目前診斷結核患者中主要采用的方法有：胸部X光片、涂片鏡檢、培養法、TST皮試等。其中X光片無法早期及時發現；涂片法敏感性特異性差；培養法耗時長，需要4-8周時間；TST皮試實驗則特異性差，無法準確區分BCG(卡介苗)接種者和結核病患者。

特異性抗原診斷一直是確認和評估病原體感染及感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價值，已經在HBV、HCV、HIV等疾病的診斷方面獲得了廣泛的應用。由于人體在對抗結核桿菌的感染中，細胞免疫起到了關鍵性的作用，所以尋找結核桿菌特異性的T細胞抗原和檢測T細胞免疫反應已經成為今年來研究的熱點。國際上已有報道的T-SPOT試劑正是使用結核桿菌的特異性抗原ESAT-6和CFP-10，以Elispot方法診斷結核早期感染(中國專利公開號：1350546)。

但是ESAT-6、Cfp-10這兩個抗原屬于結核桿菌早期分泌蛋白，在結核持續感染中分泌量減少，導致檢測的敏感性不足，局限了該試劑的推廣。另一方面有研究顯示T-SPOT試劑在發展中國家的效果并不理想，推測可能與發展中國家非結核分枝桿菌感染率高有關。另外T-SPOT試劑價格昂貴，每一人份約合80美金，在發展中國家很難推廣。

發明內容

為了解決上述現有技術中的問題，本發明的目的是提供了特異性高、能夠檢測應用范圍廣且成本低廉的檢測結核感染的試劑、方法和試劑盒。

本發明的目的之一是提供檢測分枝桿菌感染的試劑，所述試劑中包含SEQ?ID?NO?1-5所代表的蛋白、多肽或類似物中的任何一種或多種。

SEQ?ID?1:?vnsplvvgflacftliaaig

SEQ?ID?2:?atpvrlaevlvtcaaftfl

SEQ?ID?3:?wfatlgfgagrlrglftnpg

SEQ?ID?4:?lrglftnpgswrildgliav

SEQ?ID?5:?vnsplvvgflacftliaaigaqnafvlrqgiqrehvlpvvalctvsdivliaagiagfgaligahpralnvvkfggaafligygllaarrawrpvalipsgatpvrlaevlvtcaaftflnphvyldtvvllgalanehsdqrwlfglgavtasavwfatlgfgagrlrglftnpgswrildgliavmmvalgisltvt

在本發明的較佳實施例中，所述類似物包括類似肽或通過生物素/抗生物素蛋白鏈菌素系統將多個類似肽的MHC?II分子聚合在一起的聚合分子，所述類似肽與SEQ?ID?NO?1-5所代表的氨基酸序列同源。

本發明的另一目的是提供一種應用上述試劑檢測分枝桿菌的方法，包括以下步驟：

步驟1，使權利要求1所述的試劑與宿主T細胞相接觸，所述試劑中包含SEQ?ID?NO?1-5所代表的蛋白、多肽或其類似物中的任何一種或多種；

步驟2，通過測定T細胞與蛋白、多肽或類似物接觸后狀態是否發生變化，從而確定T細胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物：

能夠識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陽性、感染分支桿菌；