[發明專利]抗人LIGHT單克隆抗體及其應用

無效

• 申請號: 201110314777.1
• 申請日: 2011-10-17
• 公開（公告）號: CN102329781A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 張學光;黃子逸;王雪峰
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/24;A61K39/395;A61P31/22;A61P35/00;A61P37/02
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

技術領域

本發明屬于遺傳工程領域，涉及一種抗人LIGHT單克隆抗體及其在制備抑制T細胞體外增殖和相關細胞因子分泌的藥物中的應用。

背景技術

由免疫效應細胞活化的雙信號學說提出的共信號分子網絡表明，活化T細胞需要共刺激/抑制分子協助其產生有效的免疫應答，刺激和抑制信號的相互制約保障了機體各類免疫細胞發揮正常功能。共信號分子在結構上分為TNF/TNFR腫瘤壞死因子超家族、CD28/B7免疫球蛋白超家族以及細胞因子超家族。

腫瘤壞死因子家族(TNF?superfamily,?TNFSF)配體成員可通過旁分泌、自分泌及內分泌以膜結合或可溶性的形式而發揮作用。當其成員與對應的腫瘤壞死因子TNF受體超家族成員(TNFRSF)結合后可誘發下游產物的寡聚結合，啟動相應的信號傳導過程，包括caspases的活化、核因子(NF-κB)的轉位以及一些蛋白激酶的激活，如c-Jun??NH₂-末端激酶(JNK)、細胞外信號調節激酶(ERK)，可引起細胞凋亡、炎癥反應、自身免疫疾病以及參與細胞增殖、分化、細胞因子分泌、Ig類型轉換等許多生理病理過程。近年來發現了不少新的TNF超家族成員，已知并命名的多達十幾種。除了分泌型的LTα，TNF家族成員多為II型跨膜糖蛋白^[3]，其中TNF-α、CD40L、FasL、TRANCE的胞外段還可從細胞表面脫落，通過細胞間配體/受體模式傳遞信號。

LIGHT是其中能介導共刺激作用的配體成員之一，其表達于活化的T細胞及未成熟的樹突狀細胞，細胞表面的LIGHT分子可與金屬離子形成螯合蛋白。LIGHT與相應的受體TR2/HVEM，LT-βR或DcR3/TR6作用可介導不同的生物學效應，包括阻斷HVEM依賴的HSV1感染、誘導和調節腫瘤細胞凋亡以及刺激T淋巴細胞的增生。單純皰疹病毒侵入介質HVEM(Herpesvirus?entry?mediator)，主要表達在造血組織和淋巴組織，例如：脾臟、胸腺和純化的外周血中靜止及活化的CD4⁺、CD8^+?T細胞、CD19^+?B細胞與單核細胞都高表達HVEM，與LIGHT作用后，HVEM能夠傳遞刺激T細胞活化、增殖的正性信號；LTβR(Lymphotoxin?β?Receptor)主要表達在上皮細胞而不表達在成熟的T、B細胞，初始單核細胞和外周血DC上，在某些腫瘤細胞上，LIGHT/LTβR信號能引發細胞凋亡。可溶性受體DcR3在部分正常組織及血清中少量表達，在一些惡性腫瘤中表達明顯增加，DcR3一旦高表達可通過阻斷外源性死亡受體途徑介導細胞凋亡，與腫瘤的發生、發展密切相關。

LIGHT受體之一的HVEM可作為配體與免疫球蛋白超家族成員BTLA或CD160相互作用介導負性共抑制信號，并且相關文獻亦表明LIGHT?/?HVEM、HVEM/BTLA和HVEM/CD160間亦存在逆向信號作用，因此LIGHT/HVEM/BTLA(CD160)實現了正、負信號分子及CD28/B7、TNF/TNFR兩大超家族成員間的聯系，構成了一個共信號分子中復雜、動態的微觀免疫調節網絡。所以研究和揭示LIGHT/HVEM信號對T細胞的共刺激作用對闡述LIGHT/HVEM/BTLA(CD160)的作用特性與機理及其在T細胞調控中的地位具有重要的理論意義。

發明內容

本發明的發明目的是提供一種抗人LIGHT單克隆抗體以及能產生所述抗人LIGHT單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是：一種雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株的制備方法包括以下步驟：

1）構建高表達人LIGHT的轉基因細胞：首先，使用RT-PCR技術從活化的T細胞中擴增出人LIGHT基因，將LIGHT基因克隆入真核表達載體pIRES2-EGFP，得到重組載體pIRES2-EGFP-LIGHT；然后使用重組載體pIRES2-EGFP-LIGHT轉染L929細胞，然后篩選出高表達人LIGHT的轉基因細胞L929/LIGHT；

2）獲取融合細胞生長克隆：以步驟1）所得轉基因細胞L929/LIGHT免疫BALB/C小鼠，從免疫合格小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞，按常規方法，將B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0株融合，然后利用常規的融合細胞HAT篩選方法進行篩選，進而獲取融合細胞生長克隆；

3）應用流式細胞術、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定后，挑選出具有高抗體分泌水平的雜交瘤細胞株。