[發明專利]一種用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器及其制備方法

無效

• 申請號: 201110313373.0
• 申請日: 2011-10-17
• 公開（公告）號: CN102352413A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 曾令文;方志遠;張文娟;黃婧
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.一種用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述硝酸纖維素膜上有檢測線和質控線；所述檢測線是用鏈霉親和素和標記有生物素的SEQ?ID?NO:4序列反應后，劃在硝酸纖維素膜上形成的；所述質控線是鏈霉親和素和標記有生物素的SEQ?ID?NO:5序列反應后，劃在硝酸纖維素膜上形成的；所述金標墊上噴有膠體金；膠體金結合有如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:5的序列。

2.權利要求1所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于將硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標記寡核苷酸探針的玻璃纖維和樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經切割成寬為4mm的核酸納米金生物傳感器。

3.根據權利要求2所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述膠體金溶液的制備方法是將100g、0.01%的HAuCL₄溶液攪拌加熱到沸騰，然后加入4ml、1%的檸檬酸三鈉，溶液變為紅色后，繼續煮沸10min，停止加熱，繼續攪拌至冷卻；然后將SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:5的序列按照一定的摩爾比混合后，用去離子水溶解，加入到1-10倍體積濃縮的膠體金溶液中，混合標記1-48h，再用牛血清白蛋白或PEG封閉多余的活性位點，加NaCl和SDS，分別至終濃度為0.1-0.15M和0.01%-0.1%，老化后，8000~16000rpm離心20~60min，棄上清，重懸沉淀，即得到金標核酸。

4.根據權利要求2所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述樣品墊是玻璃纖維浸泡含有表面活性劑、電中性或堿性緩沖液（磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、Tris緩沖液、Hepes緩沖液等）、PEG4000、BSA和蔗糖的混合溶液后，37℃烘干備用。

5.根據權利要求2所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述金標墊是將金標核酸涂于玻璃纖維上，37℃干燥30min~3h，制成金標墊。

6.根據權利要求2所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的質控線是用去離子水溶解核酸序列SEQ?ID?NO:6，再取一定體積的核酸序列SEQ?ID?NO:6，加入鏈和親霉素，室溫反應30min~3h，涂于硝酸纖維素膜上，37℃干燥，得到質控線。

7.根據權利要求2所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測線是用去離子水溶解核酸序列SEQ?ID?NO:4，再取一定體積的核酸序列SEQ?ID?NO:4，加入鏈和親霉素，室溫反應30min~3h，涂于硝酸纖維素膜上，37℃干燥，得到檢測線。

8.權利要求1所述用于檢測鉛離子的核酸納米金生物傳感器的使用方法，其特征在于所述方法是將核酸酶（SEQ?ID?NO:1）和底物（SEQ?ID?NO:2）以一定比例混合，游離的底物與膠體金上標記的核酸競爭性的結合檢測線上的核酸序列，封閉檢測線上的結合位點，將待測樣品加入其中反應；如果待測樣品中含有鉛離子，則核酸酶會切斷與其互補的底物序列，游離的底物序列會減少，從而降低其封閉性，膠體金顆粒上標記的核酸序列與檢測線上的核酸序列發生反應，膠體金顆粒停留在檢測線上，從而使得檢測線顯紅色；膠體金顆粒繼續往前經過質控線，膠體金上標記的第五段核酸序列與質控線上的核酸序列發生互補配對反應，使得質控線顯紅色，為陽性結果；如果待測樣品中沒有鉛離子，則核酸酶不會切斷其互補的底物序列，上樣后，由于檢測線上的核酸完全被游離的底物序列所封閉，則不會與膠體金顆粒上標記的序列發生反應，檢測線不顯色，但膠體金顆粒上標記的序列仍然能與質控線上的序列發生反應，質控線顯紅色，為陰性結果；如果質控線不顯色，不管檢測線顯色與否，都說明生物傳感器本身出現了問題，結果不可信，為無效結果。