[發(fā)明專利]一種檢測乙酰輔酶A羧化酶活性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110313352.9
• 申請日: 2011-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN102507935A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧永忠
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/573
• 分類號(hào): G01N33/573
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測乙酰輔酶A羧化酶活性的方法，其特征在于所述酶促反應(yīng)中產(chǎn)物濃度的變化是通過酶聯(lián)免疫吸附分析的方法測定的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶活性的檢測方法，其特征在于所述酶促反應(yīng)的產(chǎn)物為乙酰輔酶A羧化酶的專一性產(chǎn)物丙二酸單酰輔酶A。

3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的酶活性的檢測方法，其特征在于

1)樣品處理：稱取一定量新鮮材料，經(jīng)搗碎、液氮研磨，或組織勻漿后，加入一定體積的提取緩沖液，或采用超聲波破碎；處理液離心10分鐘(11000rpm)，棄去殘?jiān)锨逡杭礊榇置柑崛∫海簧锨逡阂部筛鶕?jù)需要進(jìn)一步分離純化，獲得酶制品。以上過程均在0～4℃下進(jìn)行；

2)建立酶促反應(yīng)體系：100微升反應(yīng)液中，含適量酶液，1mmol/L乙酰輔酶A，1mmol/L?ATP，1mmol/L?NaHCO₃，30℃溫育15分鐘后，冰浴，并采用超濾離心的方法使酶與底物分開，終止反應(yīng)；

3)采用丙二酸單酰輔酶A酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定反應(yīng)液中丙二酸單酰輔酶A的濃度，如果測定樣品為粗酶提取液，還應(yīng)設(shè)立粗酶提取液對照；

4)酶標(biāo)儀在450nm波長下分別測定樣品孔與對照孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別求得樣品孔與對照孔丙二酸單酰輔酶A的濃度，從而計(jì)算其單位時(shí)間內(nèi)的生成速度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的酶活性的檢測方法，其特征在于不僅適用于乙酰輔酶A羧化酶純品酶活性的檢測，也適用于粗制品以及樣品提取液中酶活性的檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的酶活性的檢測方法，其特征在于適用于多種生物樣品乙酰輔酶A羧化酶活性的檢測。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶活性的檢測方法，其特征在于提取緩沖液為：60mmol/LTricine-KOH緩沖液，5％甘油，3.5mmol/L?MgCl₂，10mmol/L?DTT，2mmol/L?EDTA，pH?8.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶活性的檢測方法，其特征在于酶促反應(yīng)的終止是通過低溫及超濾離心的方法實(shí)現(xiàn)的。