[發(fā)明專利]一種氨酯鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺類聚陽(yáng)離子載體制備工藝

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110312946.8
• 申請(qǐng)日: 2011-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN102443169A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金拓;蘇靖;徐松琳;吳飛;袁偉恩;何沐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C08G73/04
• 分類號(hào): C08G73/04;C12N15/87;C12N15/85
• 代理公司: 上?？剖⒅R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效、低毒聚陽(yáng)離子載體，尤其是涉及一種體外試驗(yàn)中已證明在細(xì)胞中具有基因輸送功能的小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備、純化方法。

背景技術(shù)

基因療法是在先天和后天的多種疾病治療中的一種有力工具，因?yàn)樗梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)細(xì)胞中的生物活性蛋白的表達(dá)來預(yù)防，治療，甚至治愈疾病。基因治療在其發(fā)展過程中遇到了一系列技術(shù)瓶頸，其中最重要的瓶頸之一是基因物質(zhì)安全有效的體內(nèi)輸送。

目前常用的基因輸送載體可以分為重組病毒載體及人工合成載體(即非病毒載體)。病毒載體雖然顯示了高的轉(zhuǎn)染效率，但由于病毒的變異會(huì)引起潛在的致病危險(xiǎn)，并且病毒表面成分會(huì)引起人體免疫反應(yīng)，同時(shí)病毒的制備和純化困難且攜載基因容量小。因此非病毒基因載體被認(rèn)為是更理想的基因物質(zhì)輸送載體。

傳統(tǒng)的生物可降解高分子材料(如PGA、PLA、PLGA)不具有基因內(nèi)吞逃逸功能，所以轉(zhuǎn)染率不高，改性天然高分子如殼聚糖，其結(jié)構(gòu)在設(shè)計(jì)改造上具有局限性，而以聚乙烯亞胺(PEI)為代表的能夠幫助基因物質(zhì)內(nèi)吞逃逸的聚陽(yáng)離子則因高分子量而引起細(xì)胞毒性過大。

PEI是目前研究最為廣泛的聚陽(yáng)離子非病毒載體，分支狀分子量為25kDa的PEI(PEI?25kDa)轉(zhuǎn)染效率最高，但是PEI?25kDa同時(shí)因其烷基骨架無法降解而導(dǎo)致細(xì)胞累計(jì)毒性較大。多數(shù)的國(guó)內(nèi)外研究集中在可降解的PEI交聯(lián)衍生物。

本課題組徐松琳在控制釋放雜志(Journal?of?controlled?release，2008，130，64-68)發(fā)表了“Novel?poly(ethylene?imine)biscarbamate?conjugate?as?an?efficient?and?nontoxic?gene?delivery?system”的文章，該文章中所合成的氨酯類衍生物PEIC在與報(bào)道基因復(fù)合質(zhì)量比例為40/1時(shí)達(dá)到最大轉(zhuǎn)染活性(與商業(yè)化聚乙烯亞胺25kDa對(duì)照)，質(zhì)量比為40/1時(shí)會(huì)增加載體的載量從而會(huì)帶來更大的毒性。同時(shí)在PEIC的合成操作部分沒有考慮到純化也會(huì)帶來更大的毒性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種高效、低毒，可以用于輸送基因物質(zhì)的氨酯鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺類聚陽(yáng)離子載體制備工藝。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種氨酯鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺類聚陽(yáng)離子載體制備工藝，包括以下步驟：

(1)將聚乙烯亞胺(PEI)及1，4-丁二醇二氯甲酸酯分別溶于氯仿中，首先向PEI的氯仿溶液中加入三乙胺，然后在無水無氧條件下將1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液逐滴加入到反應(yīng)體系中后攪拌、搖動(dòng)或震蕩反應(yīng)體系，使之發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)；

(2)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓和降溫的條件下把步驟(1)制備得到產(chǎn)品中的大部分有機(jī)溶劑除去，然后再把得到的粗產(chǎn)物至于真空干燥箱內(nèi)干燥過夜；

(3)利用少量超純水溶解步驟(2)得到的產(chǎn)品后置于截留分子量為3500Da活化后的透析袋中透析48小時(shí)；

(4)透析結(jié)束后產(chǎn)品用0.22μm的微孔濾膜過濾，然后分別轉(zhuǎn)移到西林瓶中，產(chǎn)品在-20℃冰箱預(yù)凍過夜后用冷凍干燥機(jī)凍干，24h后停止凍干，即得到氨酯鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺類聚陽(yáng)離子載體產(chǎn)品。

所述的聚乙烯亞胺的分子量為800Da。

所述的聚乙烯亞胺及1，4-丁二醇二氯甲酸酯的摩爾比為3∶2。

PEI的氯仿溶液與1，4-丁二醇二氯甲酸酯的氯仿溶液的體積比為3∶20。

PEI的氯仿溶液與三乙胺的體積比為1∶2.5。

所述的聚乙烯亞胺類聚陽(yáng)離子載體產(chǎn)品可與DNA或RNA混合形成納米顆粒。

氨酯鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺類聚陽(yáng)離子載體(PEI-Bu)的分子結(jié)構(gòu)如下所示：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備了純化的氨酯類聚乙烯亞胺衍生物PEI-Bu，與PEIC相比較，在Cos-7細(xì)胞中，PEIC在質(zhì)量比為40比1時(shí)達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染活性，而本專利得到的PEI-Bu在三種不同的細(xì)胞器(Cos-7，Hep?G2和Hela)中均可以在與DNA(熒光素酶質(zhì)粒)質(zhì)量比為10比1達(dá)到最高轉(zhuǎn)染活性(圖5，6，7)，低的質(zhì)量比會(huì)帶來更為低的毒性，同時(shí)，在三種不同的細(xì)胞器(Cos-7，Hep?G2和Hela)，PEI-Bu均顯示出比陽(yáng)性對(duì)照PEI?25kDa更為顯著的細(xì)胞存活率(圖8，9，10)，因此，PEI-Bu具有高效、低毒的特點(diǎn)，可以用于輸送基因物質(zhì)。

附圖說明