[發明專利]靈芝屬間不同品種通過原生質體融合篩選富硒高產菌株的方法

無效

• 申請號: 201110311350.6
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102352349A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 何靜霞;汪潔;婁亞威;劉廣建;全衛豐;季宏更;薛璟
• 申請（專利權）人: 無錫五芝源生物農業科技有限公司;江蘇省蘇微微生物研究有限公司
• 主分類號: C12N15/04
• 分類號: C12N15/04;C12N1/14
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種不同靈芝品種間通過原生質體融合篩選富硒高產菌株的方法，屬于生物農業技術領域。

背景技術

靈芝為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，其中目前開發應用最廣的是赤芝，其子實體則是進行深加工的主要原料之一。現在眾多研究已經證實靈芝具有調節免疫、抗氧化、抗缺氧、抗放射、抗化療、抗心肌缺血作用和抗衰老作用以及鎮靜作用、強心、調節血脂作用、降血糖、平喘、保肝等作用，廣泛應用于臨床對各種疾病的治療之中。而產量高、生物性狀優異的靈芝菌種是保障靈芝生產和促進靈芝產業發展的先決條件，從野外分離的靈芝菌種大多產量不高，需要經過人工馴化和不斷的選育，以提高靈芝的產量和生產性狀，因此，菌種的選育方面的研究就顯得尤為重要了。自然選育的效率較低，而采取人工選育的方法效果較好，經過多年的研究實踐，以子實體產量和農藝性狀為主要目標的菌種選育已從最初的選擇育種、雜交育種發展到人工誘變育種、原生質體融合育種、以及運用分子生物學技術進行育種等，在食用菌育種方法上推陳出新、不斷改進，育種效率不斷提高。目前靈芝方面的菌種選育研究開展的不多，主要以紫外誘變選育靈芝的報道，但是其誘變選育效率不高，新菌種產量提升不明顯，效果不顯著，本發明通過菌絲的生長速度、形態、色素的分泌、原生質體的再生率、原生質體的滅活時間等作為確定其中一株親本為滅活菌株，經化學方法（PEG6000）進行原生質體的融合，然后通過菌絲形態、拮抗作用進行融合子的篩選，具有操作的簡便性、實用性，提高了靈芝等食用菌菌種選育的效率。

食用菌常規的菌株選育可分為自然選育和人工選育，人工選育又分為誘變育種、雜交育種和原生質體融合育種。自然育種是利用自然變異，選取所需的有益變異。誘變育種是運用物理或化學誘變劑作用菌株的DNA，使其發生遺傳變異而獲得優良性狀菌株。雜交育種是通過兩個親本適當的親本染色體片段的交換和重組而獲得新性狀從而所育出具有雙親優良性狀的育種方法。自然選育只是積累并利用自然條件下發生的有益變異，既費時又費力。誘變育種盡管具有速度快、收效大、方法比較簡便等優點，但其遺傳突變較大，難免存在著盲目性。雜交育種雖然具有一定的定向性，但由于食用菌是有極性的真菌，因不親和及細胞壁的存在使得雜交育種受到一定的限制，進程緩慢。

原生質體融合是新發展起來的一種細胞工程技術，是細胞融合的一個組成部分。它是利用酶法剝除細胞壁后，在一定物理或化學條件下使不同遺傳性狀菌株的原生質體產生融合，使兩者基因部分或全部重組，從而獲得融合子。原生質體融合子的篩選鑒定是原生質體融合過程中最關鍵的一步，也是整個融合過程成功與否的判斷。通常食用菌原生質體的鑒定，可選用營養缺陷、抗藥性突變、抗代謝突變以及熒光標記作為檢出標記。但工作過程比較復雜，工作量比較大。這些方法一般是在不同屬間如平菇與香菇間等的融合，并且已有報道。而在靈芝同屬間找出這些特征更加困難，本方法通過菌絲的生長速度、形態、色素的分泌、原生質體的再生率、原生質體的滅活時間等，作為確定其中一株親本為滅活菌株。然后通過菌絲形態、拮抗作用進行融合子的篩選，具有操作的簡便性、實用性。

目前尚未見到有關靈芝屬間不同靈芝品種通過原生質體融合篩選富硒高產新菌株的任何報道。

發明內容

本發明的目的通過靈芝屬間不同靈芝品種經原生質體融合篩選富硒高產新菌株。

本發明的技術方案：一種靈芝屬間不同靈芝品種通過原生質體融合篩選富硒高產菌株的方法，其具體步驟如下：

1、篩選以原生質體融合的靈芝出發菌株：選擇20種不同的靈芝生產菌種，進行靈芝栽培，挑選靈芝子實體產量最高、產品農藝性狀好的靈芝菌株作為高產的融合出發菌株；以及通過耐硒實驗篩選富硒能力強的靈芝菌株，作為富硒的融合出發菌株；20種不同的靈芝菌種分別為美國大靈芝、泰山靈芝、韓國靈芝、信州靈芝、惠州靈芝、日本紅芝、日本平芝、京大靈芝、甜芝、G-F1、G-F2、G-902、韓國紅芝、G1、G2、G3、G6、G8、G9、G11；

確定以美國大靈芝作為高產的融合出發菌株，惠州靈芝作為富硒的融合出發菌株。

2、篩選出的出發菌株通過以下幾個方面確定其中一株為滅活菌株：

①?觀察出發菌株菌絲的生長速度和外觀形態及菌絲色素分泌情況；

②?原生質體的再生情況；

③?原生質體滅活實驗后的再生情況。

確定惠州靈芝為滅活菌株。

3、原生質體融合：一株靈芝原生質體與另一株靈芝經滅活原生質體，經化學方法（PEG6000）進行原生質體的融合。過程為：