[發(fā)明專利]源自RHBDD1的蛋白及其在制備用于檢測結直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110310766.6
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102358754A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發(fā)明（設計）人: 宋偉
• 申請（專利權）人: 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C12N5/20;C12N9/64;C12N15/57;G01N33/577
• 代理公司: 北京同輝知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 趙慧

技術領域

本發(fā)明涉及源自RHBDD1的蛋白及其在制備用于檢測結直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體 中的用途。

背景技術

一般來說，多跨膜蛋白在進化中并不是特別保守，但是Tatusov?RL等在搜索Clusters?of? Orthlologous?Groups?of?proteins(COGs)數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)了唯一的一個非常保守的蛋白家族，即 Rhomboid蛋白家族。該家族是近年來才發(fā)現(xiàn)的，已經(jīng)在古生菌、細菌、酵母菌、蜾蠅、哺乳 動物，包括人，甚至植物等生物中發(fā)現(xiàn)了Rhomboid蛋白同源物。這是一類能夠切割單一跨 膜蛋白跨膜結構域的絲氨酸蛋白酶。

第一個Rhomboid蛋白是Christiane?Nusslein-Volhard和Eric?Wieschaus在遺傳掃描(genetic? screens)中通過突變發(fā)現(xiàn)的，并因此獲得了1995年諾貝爾獎。他們發(fā)現(xiàn)該基因突變的蜾蠅胚 胎有著Rhomboid形的頭，即菱形的頭。Rhomboid基因是相關于蜾蠅胚胎中腹外側位置信息 的四個基因之一，這也是Rhomboid蛋白家族的典型，涉及表皮生長因子受體(EGFR)信號傳 導通路的調(diào)節(jié)蛋白。

直到最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Rhomboid家族蛋白約有100種，它們均進化保守，廣泛地存在 于各種生物中。但是其序列同源性比較低，只是具有保守的Rhomboid結構域。如此保守的 蛋白質(zhì)在數(shù)萬年的進化過程中保存下來，肯定有其重要的作用。盡管目前人們對這個家族蛋 白的認識還很膚淺，只是集中在果蠅中的一些了解，但是從這些初步的結果以及其逐漸體現(xiàn) 出的獨特作用來看，如果進一步深入研究這些蛋白質(zhì)的功能將有助于我們認識關于細胞之間 信息傳導的詳細機制。

Rhomboid家族蛋白的表達受調(diào)控，而且催化底物具有特異性，這可能暗示這些蛋白質(zhì)在 某些重要組織中有作用。它既體現(xiàn)了類似于一些管家蛋白的保守性，卻沒有管家蛋白的表達 普遍性，又體現(xiàn)了類似于組織細胞特異表達蛋白的特異性，卻又有著代表一類蛋白的保守性； 所以，它們可能在一些對于生物發(fā)育成長重要的事件中發(fā)揮重要作用。

RHBDD1是發(fā)明人所在實驗室從睪丸抑制性消減雜交文庫中篩選出的一個在睪丸組織中 高表達的新基因(GenBank登錄號：AY640233)。該基因在人中表達全長為315個氨基酸， 含有四個跨膜結構域，其215-315位氨基酸為一段高度親水區(qū)。蛋白結構域分析表明，在其 61-214位氨基酸含有一個高度保守的Rhomboid結構域，故該蛋白屬于Rhomboid蛋白酶家族 的新成員。實驗室前期對RHBDD1的功能進行了較為深入的研究，包括：發(fā)現(xiàn)RHBDD1通 過特異性切割并降解促凋亡蛋白質(zhì)BIK而發(fā)揮抑制凋亡的作用(Cellular?and?Molecular?Life Sciences?65：3822-9，2008)；應用自己建立并完善的小鼠精子發(fā)生重塑模型觀察RHBDD1對精 子發(fā)生的影響，結果發(fā)現(xiàn)RHBDD1基因敲減后明顯抑制GC-1細胞的分化發(fā)育(BMC?Cell?Biol 10：25，1-7，2009)；RHBDD1可以特異性切割腫瘤抑制子活化通路蛋白6(TSAP6)，進而 參與調(diào)節(jié)TSAP6介導的外體分泌過程(文章在投稿中)；此外，發(fā)現(xiàn)RHBDD1具有特異性的 促進AP-1信號通路的作用，可能在促進細胞周期、癌癥發(fā)生中發(fā)揮特定作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是基于RHBDD1的功能研究提供RHBDD1在制備臨床診斷試劑或治療試 劑方面的用途。

本發(fā)明提供了源自RHBDD1的蛋白在制備用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的 用途，主要為：將RHBDD1的215-315位氨基酸作為抗原表位，制備單克隆抗體，該單克隆 抗體即為用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體，RHBDD1的215-315位氨基酸的序列如 SEQ?ID?NO：1所示。

較佳地，所述制備單克隆抗體的方法為雜交瘤技術制備單克隆抗體。

雜交瘤技術制備單克隆抗體的主要步驟可以包括：

(1)抗原制備；

(2)免疫動物；

(3)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；

(4)細胞融合；

(5)雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)；

(6)雜交瘤細胞的篩選；

(7)雜交瘤細胞的克隆化；

(8)單克隆抗體的檢定；