[發(fā)明專利]一種用于擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)分析的DGGE引物

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110310598.0
• 申請(qǐng)日: 2011-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN103045719A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張艷軍;謝明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張艷軍
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)分析的DGGE引物，可用于擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE鑒定分析。

背景技術(shù)

擬青霉(Paecilomyces)屬半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科真菌，是自然界廣泛存在的一類真菌，其中包含非常優(yōu)良的昆蟲病原真菌，如粉擬青霉(Paecilomyces.farinosus)、玫煙色擬青霉(Paecilomyces.fumosoroseus)、淡紫擬青霉(Paecilomyces.lilacinus)等，已被成功開發(fā)成多種商品制劑用于農(nóng)林害蟲的生物防治。然而，擬青霉的田間防效與其在自然土壤中的存活能力和優(yōu)良菌株在擬青霉群落中的豐度有很大關(guān)系。對(duì)土壤中擬青霉真菌的研究，傳統(tǒng)方法依賴于選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)或大蠟螟誘集法，這兩種方法耗時(shí)又費(fèi)力。基于PCR的分子檢測(cè)技術(shù)可對(duì)土壤中擬青霉真菌的種類、數(shù)量和分布進(jìn)行研究，卻無法對(duì)其群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)由Fischer和Lerman于1979年最早提出，是檢測(cè)DNA堿基突變的一種電泳技術(shù)。Myers于1985年首次在DGGE中應(yīng)用GC發(fā)夾技術(shù)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可防治DNA片段在DGGE凝膠中完全解鏈，DNA片段中每個(gè)堿基處的序列差異基本都可被區(qū)分檢測(cè)到，使DGGE技術(shù)日臻完善。與傳統(tǒng)的微生物研究方法相比，DGGE的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠快速、準(zhǔn)確的鑒定各種樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律和種群動(dòng)態(tài)，而無需對(duì)所研究的微生物進(jìn)行純種培養(yǎng)，擺脫了微生物難以培養(yǎng)的限制。DGGE的另一優(yōu)點(diǎn)就是能夠同時(shí)對(duì)比分析大量的樣品，既可比對(duì)分析不同微生物群落間的差異，也可研究同一微生物群落隨時(shí)間和外部環(huán)境壓力的變化過程。因此，DGGE技術(shù)已成為微生物群落遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)分析的強(qiáng)有力工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物用于擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的問題，而提供一種用于擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物。

本發(fā)明用于擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物為：正向引物dPacF(5’-GGAGACCCCCAAACTCTGTATTC-3’)和反向引物dPacR-gc(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTTCCGGTGCGAGTTGGATTACTA-3’)。

本發(fā)明的引物是根據(jù)擬青霉屬真菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物dPacF/PacR-gc可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為385bp的目的片段，通過DGGE分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可提供樣品中擬青霉真菌群落結(jié)構(gòu)的信息。

附圖說明

圖1為采用引物dPacF/PacR-gc對(duì)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜。M泳道為DNA?marker?BM2000，1-4號(hào)泳道為樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5號(hào)泳道為清水對(duì)照。

圖2為圖1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

土壤樣品DNA提取：稱取5g土壤樣品和1g玻璃珠至50mL離心管，加入13.5mL?DNA提取液(0.1mol/L?Tris?base，0.1mol/L?EDTA，0.1mol/L磷酸鈉，1.5mol/L?NaCl，1％CTAB，pH8.0)混合，加入100μL蛋白酶K(10mg/mL)，置搖床，225r/min，37℃搖30min；加入1.5mL?SDS(20％)，置水浴鍋，65℃水浴2h，每隔15～30min緩慢顛倒離心管數(shù)次；取出后室溫，3000rpm離心5min，收集上清液至新的50mL離心管；土壤樣品沉淀繼續(xù)加4.5mL?DNA提取液和0.5mL?SDS(20％)，渦旋10s，置水浴鍋，65℃水浴10min，收上清液，與前一次上清液合并，重復(fù)上述操作，收集上清液與前兩次上清合并；上清液加入等體積氯仿-異戊醇(體積比為24∶1)，12000rpm離心5min；將水相轉(zhuǎn)至50mL離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1h，室溫16000rpm離心20min；收核酸沉淀，加入70％乙醇(冷)，洗滌沉淀兩次，重懸于TE緩沖液，最終體積500μL。