[發(fā)明專(zhuān)利]一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110309442.0
• 申請(qǐng)日: 2011-10-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102335198A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭秀俠;楊屹;苗麗;劉巖;蔡月紅;李宇輝;崔文廣;姜文波;井偉東;苑志剛;丁麗麗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K35/16
• 分類(lèi)號(hào): A61K35/16;A61K39/395;A61P31/14
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，應(yīng)用于森林腦炎病毒抗血清的生產(chǎn)。

背景技術(shù)

森林腦炎又稱(chēng)蜱傳腦炎(tick-borne?encephalitis，TBE)是由森林腦炎病毒(tick-borneencephalitis?virus，TBEV)引起的一種流行于北溫帶的、以侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性病毒性傳染病。世界范圍內(nèi)受森林腦炎病毒侵襲的國(guó)家除我國(guó)外，主要還包括：德國(guó)、奧地利、匈牙利、俄羅斯及日本等近30個(gè)國(guó)家。在我國(guó)，森林腦炎主要存在三大疫區(qū)、六個(gè)自然疫源地，主要分布于我國(guó)的大、小興安嶺地區(qū)和長(zhǎng)白山地區(qū)，在同緯度的新疆部分地區(qū)亦有分布。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化及分布地域的不同，森林腦炎病毒可以被分為三個(gè)亞型：歐洲亞型(European?subtype)、遠(yuǎn)東亞型(Far?Eastern?subtype)及西伯利亞亞型(Siberiasubtype)。森林腦炎病毒的三個(gè)亞型在傳播媒介、致病性強(qiáng)弱、致死率高低以及預(yù)后等方面表現(xiàn)不盡相同。其中，歐洲亞型致病性相對(duì)較低，致死率約0～3.9％，預(yù)后良好，幾乎無(wú)嚴(yán)重的后遺癥發(fā)生。遠(yuǎn)東亞型及西伯利亞亞型致病性相對(duì)較強(qiáng)，致死率也較高，約為20～30％，且預(yù)后不好，在未死亡病例中約有25～37％的患者會(huì)留下麻痹型后遺癥，從而喪失勞動(dòng)能力，給社會(huì)及家庭造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。我國(guó)流行株為遠(yuǎn)東亞型。

森林腦炎病毒在感染后采用血清療法可以防止發(fā)病或減輕癥狀。血清療法即發(fā)病3天內(nèi)患者可用恢復(fù)期患者或林區(qū)居住多年者的血清20～40ml肌注，或椎管內(nèi)注射5～10ml。由于現(xiàn)在沒(méi)有已經(jīng)上市的抗森林腦炎血清和免疫球蛋白，血清療法使用的是人血清，這存在感染HIV、HCV、HBV等血源性病毒的巨大風(fēng)險(xiǎn)，而且來(lái)源非常有限，不能大范圍使用。森林腦炎目前尚無(wú)有效的治療手段，抗森林腦炎馬血清可作為暴露后預(yù)防和發(fā)病早期治療的特效藥。目前無(wú)上市的抗森林腦炎病毒馬血清。

馬血清蛋白對(duì)人體來(lái)說(shuō)屬異源蛋白，對(duì)人體有很強(qiáng)的致敏性。馬血清制品，常引起下列兩類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)：(1)過(guò)敏性休克，在注射過(guò)程或注射后數(shù)分鐘到1h內(nèi)患者突感胸悶、氣急、脈搏加速、血壓下降，發(fā)冷直到昏迷，重者搶救不及時(shí)，可迅速死亡。此系I型過(guò)敏反應(yīng)，即人體曾注射或接觸過(guò)馬血清，致敏而產(chǎn)生IgE細(xì)胞抗體，固定在嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面，再注射馬血清制品時(shí)，抗原抗體相互作用，致上述細(xì)胞破裂釋放大量生物活性物質(zhì)如白三烯、組織胺等，作用于機(jī)體引起過(guò)敏。(2)血清病(serum?sickness)，即注射馬血清制品后1～2周出現(xiàn)蕁麻疹、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、臉部紅腫、偶有蛋白尿、嘔吐及關(guān)節(jié)疼痛等，此系III型過(guò)敏反應(yīng)，即一次性接受較大劑量馬血清制品注射，機(jī)體產(chǎn)生的相應(yīng)IgG與體內(nèi)殘留的過(guò)敏原馬血清結(jié)合，形成可溶性循環(huán)免疫復(fù)合物。沉積于毛細(xì)血管內(nèi)壁，激活機(jī)體，引起局部炎癥所致。

正常未經(jīng)免疫的馬匹體內(nèi)由于自身免疫作用會(huì)有針對(duì)不同病毒的中和抗體IgG，但含量均很低，經(jīng)森林腦炎病毒抗原免疫的馬匹，在馬匹的血清內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量能夠中和抗森林腦炎病毒的中和抗體IgG，IgG由F(ab)₂段和Fc段組成，其中起到中和病毒作用的成份為F(ab)₂段，而Fc段會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，而如何在制備抗森林腦炎馬血清的過(guò)程中、獲得高純度的針對(duì)森林腦炎病毒的特異性F(ab)₂段又是十分困難的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法，以解決馬血清制品常引起過(guò)敏反應(yīng)的問(wèn)題。

本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器技術(shù)培養(yǎng)森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”，能夠獲得高滴度的病毒收獲液，經(jīng)滅活純化，添加適合的佐劑制備免疫抗原；選擇最佳的免疫程序和采血程序，獲得高特異性、高效價(jià)的免疫血清；應(yīng)用以柱層析技術(shù)為核心的抗血清純化工藝，提高抗血清純度，增加F(ab′)₂含量。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，包括下列步驟：

(1)、森林腦炎毒株采用森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；

(2)、采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞，感染病毒，上罐細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，加入病毒量為1∶100～200，制備病毒原液，采用β-丙內(nèi)酯滅活病毒，制備抗原，另外加入弗氏不完全佐劑；

(3)、馬匹免疫程序及采血程序：一個(gè)免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)?天、3天、10天、17天、35天，每次免疫為頸部皮下2.0ml/匹；采血從第15天開(kāi)始靜脈采血，每隔7天采一次，每次3000ml；

(4)、血漿制備；

(5)、消化、滅活；