[發明專利]一個靶向抑制羊痘病毒P32基因的siRNA序列及應用

無效

• 申請號: 201110309096.6
• 申請日: 2011-10-13
• 公開（公告）號: CN102337264A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 張強;趙志荀;吳國華;顏新敏;李鍵;朱海霞;崔立凡;高順平;才學鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K48/00;A61P31/20;A01K67/027
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一個序列，以及這個序列的用途。確切講本專利涉及一種可抑制羊痘病毒的序列，以及這個序列的用途。

背景技術

羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(Sheeppox?virus，SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox?virus，GTPV)分別引起綿羊和山羊發生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現丘疹或結節、水皰、內臟病變甚至死亡，給世界養羊業造成了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將其規定為法定必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。羊痘的預防和控制一直是研究的熱點。

P32蛋白是羊痘病毒的囊膜蛋白，由319-324個氨基酸組成，具有跨膜的螺旋結構，該結構位于C端287～307位氨基酸處。P32蛋白是從羊痘病毒感染細胞中分離得到的結構蛋白，分子量為32kDa。此蛋白為目前世界各地分離、鑒定的CPV的各毒株所共有特異很強且含有重要的抗原決定簇，它能夠刺激豚鼠迅速產生抗CPV的中和抗體。P32蛋白是羊痘病毒基因組中研究背景相對最為清楚的蛋白，因此，如果干擾掉羊痘病毒的P32基因的表達，將會降低病毒的免疫原性，從而降低病毒的致病性。但目前世界上并沒有基于RNA干擾技術靶向羊痘病毒的研究的報道，也沒有RNA干擾方法在P32蛋白的研究的報道。因此P32基因作為RNA干擾靶向的目的基因是一個較為理想的選擇。

發明內容

本發明給出一個人工序列，實驗中這一序列表現出對羊痘病毒P32基因具有抑制作用。

本發明的序列為：GUGCUCCUAUUAUACUAAU，在本發明中被命名為siRNA-P32。

相關的實驗表明，本發明的序列siRNA-P32可以抑制羊痘病毒P32基因的表達。

相關的實驗提示本發明的序列siRNA-P32可在制備抗羊痘病毒的疫苗中的應用，也可在制備抗羊痘病毒的藥物中的應用。

更進一步，本發明的序列siRNA-P32可在培育具有抗羊痘病毒的羊品種中應用。例如敲除相關的基因以培育對羊痘病毒具有自然抵抗能力的羊的新品種。

附圖說明

圖1為空載體pEGFP-N1轉染BHK21細胞對照熒光表達觀察圖，其中左圖和右圖分別為空載體表達后在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場和明場下的表達情況。

圖2為重組質粒pEGFP-P32轉染BHK21細胞對照熒光表達觀察，即P32基因真核表達載體構建以后在BHK21細胞中表達的鑒定，其中左圖和右圖分別為pEGFP-P32表達后在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場和明場下的表達情況，從圖2可看出pEGFP-P32在BHK21細胞中得到了表達。

圖3為pEGFP-P32和陰性對照siRNA共轉染BHK21細胞熒光表達觀察，其中左圖和右圖分別為pEGFP-P32和siRNA陰性對照共轉染后在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場和明場下的表達情況。

圖4為未轉染質粒的BHK21細胞陰性對照熒光表達觀察，即空白對照圖，其中左圖和右圖為什么也沒有轉染的BHK21細胞在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場和明場下的表達情況。

圖5為pEGFP-P32和siRNA-P32共轉染的BHK21熒光表達觀察，其中左圖和右圖分別為共轉染pEGFP-P32和siRNA-P32的BHK21細胞在在熒光顯微鏡采用綠色熒光暗場和明場下的表達情況。

由上述圖中看出，跟對照相比，圖5所示的共轉染pEGFP-P32和siRNA-P32的組熒光明顯少于對照組的圖3，這說明siRNA-P32能夠抑制P32的表達。

圖6為未轉染的陰性細胞對照組的流式細胞儀檢測結果。

圖7為只轉染空載體pEGFP-N1的細胞經流式細胞儀檢測結果。

圖8為重組質粒pEGFP-P32和對照siRNA共轉染BHK21細胞后經流式細胞儀檢測，結果轉染了siRNA對照后，pEGFP-P32表達陽性細胞率為60％。

圖9為重組質粒pEGFP-P32和siRNA-P32共轉染BHK21細胞后經流式細胞儀檢測，結果轉染了siRNA-P32后，pEGFP-P32表達陽性細胞率為4.2％。與陰性對照組相比，pEGFP-P32表達下降了93％。