[發明專利]水稻葉鞘腐敗病的PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110308798.2
• 申請日: 2011-10-13
• 公開（公告）號: CN102304588A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 易圖永;高必達;趙慧茹
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術領域：

本發明涉及一種水稻病的檢測方法，尤指一種檢測水稻葉鞘腐敗病(ricesheath?rot)的PCR(聚合酶鏈式反應)方法。

背景技術：

水稻葉鞘腐敗病是一種在水稻栽培地區嚴重發生的由水稻葉鞘腐敗病菌(Sarocladium?oryzae(Sawada)Gams?&?Hawksworth)所引起的真菌性病害。在秧苗期至抽穗期均可發病，每年造成嚴重損失。幼苗染病葉鞘上生褐色病斑，邊緣不明顯。分蘗期染病葉鞘上或葉片中脈上初生針頭大小的深褐色小點，向上、下擴展后形成菱形深褐色斑，邊緣淺褐色。葉片與葉脈交界處多現褐色大片病斑。孕穗至抽穗期染病劍葉葉鞘先發病且受害嚴重，葉鞘上生褐色至暗褐色不規則病斑，中間色淺，這緣黑褐色較清晰，嚴重的現虎斑紋狀病斑，向整個葉鞘上擴展，致葉鞘和幼穗腐爛。濕度大時病斑內外現白色至粉紅色霉狀物，即病原菌的子實體。

研究發現，水稻葉鞘腐敗病種子帶菌率為59.7％，病菌可侵至穎殼、米粒，病菌在種子上可存活到翌年8～9月。帶菌種子發芽后，病菌從生長點侵入，隨稻苗生長而擴展，有系統侵染的特點，發病后病部形成分生孢子借氣流傳播，進行再侵染。對于水稻種子是否攜帶有水稻葉鞘腐敗病菌，前人主要通過對種子所攜帶的微生物進行分離培養，再根據培養物所產生孢子的形態特征進行鑒定。這種方法不僅因為分離培養時間長，同時也由于雜菌污染影響分離效果，檢出效率不高。因此，有必要建立一種能準確鑒定水稻葉鞘腐敗病的快速檢測方法。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是：針對上述現有技術的不足，提供一種能準確鑒定水稻葉鞘腐敗病的PCR檢測方法。該方法所使用的一對引物是水稻葉鞘腐敗病菌的轉錄間隔區(internal?transcribed?spacer?1，ITS)特異的，本檢測技術所使用的這對引物有別于其它檢測技術。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：一種水稻葉鞘腐敗病的PCR檢測方法，該方法是以水稻葉鞘腐敗病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定；該特異性引物為：

正向引物：5’-TCGTTCCCTCGGCGGGAC-3’

反向引物：5’-AGGTGCGCCCCGAAGGTC-3’。

上述特異性引物的設計是基于水稻葉鞘腐敗病菌的轉錄間隔區的核苷酸序列，PCR產物大小為295bp。

對本發明方法詳細敘述如下：

一、引物設計：

本發明人利用真核生物進化過程中核酸序列的保守性，從NCBI搜索并下載水稻葉鞘腐敗病菌(Sarocladium?oryzae?strain?CBS?361.75)的轉錄間隔區(internal?transcribed?spacer)的核苷酸序列(序列號為AY566993)以及Acremonium?alternatum?CBS?233.70、Acremonium?strictum?CBS?346.70，Cephalosporium?caerulens?KF-140的轉錄間隔區(ITS)序列，運用MEGA4.0軟件對這些序列進行比對，從擴展名為mas的文件中找出不同研究者報告的水稻葉鞘腐敗病菌核苷酸序列所共有而其它真菌序列均與之不同的引物候選區，設計出一對引物：

引物1：5’-TCGTTCCCTCGGCGGGAC-3’

引物2：5’-AGGTGCGCCCCGAAGGTC-3’。

將引物1和引物2分別經BLAST檢索，見下表1及表2，結果表明，與引物1和引物2的序列100％覆蓋且100％相同的全部是水稻葉鞘腐敗病菌的核苷酸序列。Cephalosporium?caerulens與Sarocladium?oryzae是同種真菌。

表1?水稻葉鞘腐敗病菌引物1的BLAST結果

表2?水稻葉鞘腐敗病菌引物2的BLAST結果

由此，設計出一對特異性引物：

正向引物：5’-TCGTTCCCTCGGCGGGAC-3’

反向引物：5’-AGGTGCGCCCCGAAGGTC-3’(反向引物使用時需顛倒互補)。

上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，預期的PCR產物為295個堿基。

二、PCR過程：

用上述引物對對水稻鞘腐病株以及種子進行PCR檢測。

PCR反應體系為2μl，具體見下表3：

表3?PCR反應體系各主要成分及用量