[發明專利]一種清除偽狂犬疫苗種毒中的支原體的方法

有效

• 申請號: 201110308008.0
• 申請日: 2011-10-12
• 公開（公告）號: CN102352365B
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 張博;鄺聲耀;郭萬柱;陰文奇
• 申請（專利權）人: 四川華神獸用生物制品有限公司
• 主分類號: C12N15/38
• 分類號: C12N15/38;C12N15/63;C12N7/00;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽

技術領域

本發明涉及一種清除偽狂犬疫苗種毒中的支原體的方法，屬于生物制品 領域。

背景技術

偽狂犬病毒(Pseudorabies?virus，PRV)屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒 亞科，是一種單股雙鏈DNA病毒，有囊膜，可引起多種家畜和野生動物出 現以發熱、奇癢及腦脊髓炎為主要病癥的急性傳染病-偽狂犬病。豬是偽狂 犬病毒原發感染宿主，感染后可引起仔豬大批發病、死亡，引起母豬繁殖功 能障礙-流產或產木乃伊胎、死胎、弱胎。

偽狂犬病在世界范圍內分布廣泛，對豬業健康發展的危害程度僅次于口 蹄疫、豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征。疫苗接種是有效防制偽狂犬疫病的重要 手段，故偽狂犬疫苗接種也是我國各型豬場基本免疫程序的重要一環，我國 巨大的生豬存欄量決定了偽狂犬疫苗市場容量之巨，現我國市面上已有數十 家疫苗生產企業生產的偽狂犬疫苗，但是由于支原體對疫苗的污染，導致生 產成本較高，且疫苗的安全性難以控制。

支原體(Mycoplasma)：又稱霉形體，是介于細菌及病毒之間的一種原 核生物，無細胞壁和固定形態，大小介于0.2-0.3μm之間，大部分可通過普 通0.22μm細菌濾器。支原體污染會干擾細胞正常新陳代謝，影響DNA和 RNA的合成，從而引起病毒產量下降，影響產品品質；同時支原體注入動物 機體內會造成動物免疫抑制甚至發病，我國頒布的《中華人民共和國獸藥典》 明文規定疫苗制品內不能含有支原體。

偽狂犬疫苗生產的核心是偽狂犬種毒的制備，其在復蘇、增殖及建立種 子庫的過程中面臨受支原體污染的風險較大，而種毒是疫苗生產最初始的上 游源頭，一旦種毒發生支原體污染，將造成極其嚴重的后果。因此，除去疫 苗種毒中的支原體是至關重要的，也是偽狂犬疫苗生產企業及科研人員極力 解決的關鍵問題之一。

除了通過合理清潔消毒、嚴格按規范操作降低支原體污染發生風險之外， 目前已經報道的清除種毒支原體污染常見方法有很多種，如，過濾法、抗生 素處理法、高溫處理法、接種動物法和接種動物法。但是，現有的方法均不 能在保證偽狂犬病毒存活的情況下，徹底除掉支原體：1.過濾法：已有孔徑 小于0.22μm的濾器可以濾去大多數病毒中的支原體，但是由于偽狂犬病毒 粒子大小為0.18μm左右，其與支原體大小很接近，目前通過過濾無法將二 者有效分開；2.抗生素處理法：支原體對某些抑制蛋白合成的抗生素敏感， 如氯霉素、慶大霉素、喹諾酮類及環丙沙星類，據報道這些藥物能良好抑制 或殺滅支原體，同時不影響病毒活性，但是這些抗生素對細胞有潛在毒性， 同時其以抑制為主要的作用機理讓人對其徹底殺滅支原體的效果擔憂，該方 法存在殺滅不徹底，停藥后可能反復的風險，即使徹底殺滅整個用藥周期至 少需要14-21天的時間，另外，抗生素使用帶來的耐藥性問題是其另外一個 難以預料的副作用；3.高溫處理法：加溫至40-50℃維持一段時間，利用高 溫破壞支原體活性進而殺滅支原體，但是同處于一個體系中的病毒粒子的活 性也會受到影響甚至失活，4.接種動物法：此法是將受支原體污染的病毒液 接種于實驗動物如小鼠皮下或腹腔，利用動物的免疫系統殺滅支原體，但是 此法對動物衛生等級要求甚高，否則會有引入外源微生物的風險，至少需要 SPF級，因而操作復雜、成本高、飼養管理難度大，很難保證殺滅徹底，周 期較長。另一方面，偽狂犬疫苗種毒對豬是安全的，對小鼠或兔卻具有致病 性，即實驗動物機體在徹底清除支原體前就會因偽狂犬發病死亡，難以達到 去除支原體的目的；5.溶劑抽提法：印彤等，“采用溶劑抽提法可完全去除 病毒制品中的支原體”，1996年第19卷第1期報道了利用乙醚和氯仿對污染 支原體的5型腺病毒和RNA?α病毒進行抽提可在保持病毒效價的前提下，完 全除去其中支原體，但是偽狂犬病毒對乙醚和氯仿高度敏感，極易失活，發 明人曾多次根據該文獻報道的方法除去偽狂犬種毒中的支原體，結果發現該 方法殺死支原體后，偽狂犬種毒本身也失活即病毒經此處理后死亡，無法重 新增殖出病毒，不能再用于制備偽狂犬疫苗，不具有實際應用的價值。

綜上，人們一直以來尋找許多方法來去除偽狂犬病毒中的支原體，但是 都未能達到理想的效果，要么難以徹底除去支原體，要么在徹底除去支原體 的同時也會殺滅偽狂犬病毒。為了保證偽狂犬疫苗的品質，亟需尋找一種徹 底除掉支原體，且能保證偽狂犬病毒活性的方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種新的去除偽狂犬疫苗種毒中的支 原體的方法。