[發明專利]轉基因動物及其制備方法

有效

• 申請號: 201110306701.4
• 申請日: 2011-10-11
• 公開（公告）號: CN102367454A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 李勇;戰麗萍;劉歡;杜玉濤;王俊;汪建;楊煥明
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一組適于轉化細胞的載體，其特征在于，包括：

第一載體，所述第一載體包含附著子序列；以及

第二載體，所述第二載體包含目的核酸序列，

其中，

所述附著子序列優選包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列，更優選包含編碼EBNA1和/或核基質附著區的核酸序列，可選地所述染色體骨架結合區是EBNA1；

任選地，所述第一載體進一步包括編碼復制起始點的核酸序列，所述復制起始點優選為oriP；

任選地，所述第一載體進一步包括編碼篩選標記的核酸序列，所述篩選標記優選為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種；

任選地，所述第二載體進一步包含啟動子，所述啟動子與所述目的核酸序列可操作地連接，所述啟動子優選為真核細胞啟動子，所述真核細胞啟動子優選為選自CAG啟動子和PGK啟動子的至少一種，可選地所述真核細胞啟動子為組織特異性啟動子；

任選地，所述第二載體進一步包含增強子序列，所述增強子序列與所述目的核酸序列可操作地連接，所述增強子優選為CHS4增強子。

2.根據權利要求1所述的一組適于轉化細胞的載體，其特征在于，所述目的核酸序列的兩端分別具有適于同源重組的核酸序列，所述適于同源重組的核酸序列優選為細胞基因組中的非功能片段。

3.一種適于轉化細胞的載體，其特征在于，所述載體包含附著子序列，

其中，

所述附著子序列優選包含編碼染色體骨架結合區和/或核基質附著區的核酸序列，更優選包含編碼EBNA1和/或核基質附著區的核酸序列，可選地所述染色體骨架結合區是EBNA1；

任選地，所述載體進一步包括編碼復制起始點的核酸序列，所述復制起始點優選為oriP。

4.根據權利要求3所述的適于轉化細胞的載體，其特征在于，

所述載體進一步包括編碼篩選標記的核酸序列，所述篩選標記優選為選自編碼發光蛋白的基因、藥物抗性基因的至少一種，所述發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少一種，所述藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一種。

5.一種制備轉基因細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

使用權利要求1或2所述的一組適于轉化細胞的載體轉化宿主細胞，以便獲得轉基因細胞，優選利用所述第一載體和所述第二載體共轉化所述宿主細胞，任選地通過脂質體法進行所述共轉化；以及

分離轉基因細胞，其中，所述轉基因細胞的染色體中含有所述目的核酸序列。

6.根據權利要求5所述的制備轉基因細胞的方法，其特征在于，進一步包括：

通過PCR方法驗證所述轉基因細胞的基因組中含有所述目的核酸序列的步驟。

7.一種轉基因動物細胞或其培養物，其中所述非人轉基因動物細胞或其培養物是根據權利要求5或6所述的方法獲得的，優選所述動物為非人動物。

8.一種制備非人轉基因動物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提取權利要求7所述非人轉基因動物細胞或其培養物的細胞核；

將所述細胞核引入所述動物的無核卵母細胞中，以便獲得融合卵母細胞；

將所述融合卵母細胞在適宜的條件下進行培養，以便獲得所述非人轉基因動物。

9.根據權利要求8所述的制備非人轉基因動物的方法，其特征在于，

所述無核卵母細胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質而獲得的。

10.一種非人轉基因動物或其后代，其中所述非人轉基因動物是根據權利要求8或9所述的方法獲得的。