[發明專利]一種熒光原位雙雜交方法

無效

• 申請號: 201110306469.4
• 申請日: 2011-10-11
• 公開（公告）號: CN102321766A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 武勝昔;魏燕燕;黃靜;陳晶;王文;李云慶
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責任公司 61108
• 代理人: 邱志賢

1.一種熒光原位雙雜交方法，其特征是：它包括以下具體步驟是：?

1）用含有H₂O₂終濃度為2%的摩爾濃度為0.1?mol/L的?DEPC-PB?孵育切片1次，室溫，10-15分鐘；所述的H₂O₂終濃度為2%?，所述的0.1mol/L?DEPC-PB:是用磷酸氫二鈉29.0克，磷酸二氫鈉2.9克，用超純水定容至1L后，再加入體積百分比為0.1%的DEPC?1ml過夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述的切片為生物組織切片；

2）用摩爾濃度為0.1?mol/L的?DEPC-PB孵育步驟1）中處理過的切片1次，室溫，10-20?分鐘；

3）用含有Triton?X-100終濃度為0.3%的摩爾濃度為0.1?mol/L的?DEPC-PB孵育步驟2）中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；所述的Triton?X-100?終濃度為0.3%；

4）50?ml的乙酰化液孵育步驟3）中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；

5）摩爾濃度為0.1?mol/L?DEPC-PB孵育步驟4）中處理過的切片2次，室溫，各10?-15分鐘；

6）在雜交液中孵育步驟5）中處理過的切片，此過程稱為預雜交，溫度為60℃，所需時間1-2小時；?

7）在雜交液中加入DIG標記的探針，同時再加入FITC標記的探針，DIG標記的探針和FITC標記的探針的終濃度為1ug/ml,?雜交過夜16-20小時，雜交溫度根據探針引物的退火溫度來確定；

8）從步驟7）所述的雜交液中取出切片用洗滌液清洗2次，60?℃，各20-30分鐘；

9）用RNA緩沖液孵育步驟8）中處理過的切片1次，37℃，20-30分鐘；

10）用加入RNA酶的RNA緩沖液孵育步驟9）中處理過的切片，37℃，30-40分鐘；所述的RNA酶終濃度為20ug/ml；

11）用2?X?SSC孵育步驟10)?中處理過的切片2次，?37℃，各20-30分鐘；

12）用0.2x?SSC孵育步驟11）中處理過的切片2次，?37℃，各20-30分鐘；

13）用TS7.5孵育步驟12）中處理過的切片1次，室溫，5-10分鐘；所述的TS7.5是由摩爾濃度為0.1?mol?/L?Tris-HCl,?PH?7.5,?摩爾濃度為?0.15??mol?/L?NaCl溶液用超純水配制而成；

14）用TBS封閉將步驟13）中處理過的片子封閉，室溫孵育1-2小時；所述的TBS:?是由TS7.5和體積百分比為1%的Blocking?Reagent配制而成；?

15）按1:200的抗體效價，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步驟14）中處理過的切片，室溫，過夜；　

16）用TNT于室溫洗滌步驟15）中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；?所述的TNT:?是由?TS7.5和體積百分比為0.05%?Tween20配制而成；??

17）用摩爾濃度為0.1?mol/L?的PB洗滌步驟16）中處理過的切片1次，室溫，10-15分鐘；

18）TSA-Biotin?反應，放大雜交信號：

　　　????????????????????????????????????????????????將步驟17)中處理過的切片加入反應液中，室溫，孵育10-15分鐘；

　　　在上述反應液中加入50ul的濃度為200mg/ml??-D葡萄糖，于室溫孵育30分鐘；

19）用0.1?mol?/L?的PB洗滌步驟18)中處理過的切片，室溫，10-20分鐘；

20）在NaN₃的終濃度為2%的0.1?mol/L的?PB中孵育步驟19)?處理過的切片，室溫，10-15分鐘；

21）用TNT洗滌步驟20)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；

22）按1:2000的抗體效價，用TBS稀釋Anti-Fluorescein-POD抗體，室溫孵育步驟21)中處理過的切片，過夜；?

23）用TNT洗滌步驟22)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；

24）?TSA-DNP反應：根據試劑盒的說明書操作，按照1：50比例將TSA-DNP稀釋后孵育步驟23)中處理過的切片；?

25）用TNT洗滌步驟24)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；

26）用TNT按照2種熒光抗體：Alexa488-DNP和Streptavidin?-?Cy3的效價1：200同時稀釋這兩種熒光抗體，室溫孵育步驟25)中處理過的切片2-4小時；

27）用TNT洗滌步驟26)中處理過的切片2次，室溫，各10-15分鐘；

28）將步驟27)中處理過的切片表片，封片。