[發明專利]用于檢測番茄黃化曲葉病毒的引物、TaqMan探針和試劑盒

有效

• 申請號: 201110305910.7
• 申請日: 2011-10-11
• 公開（公告）號: CN102417934A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 葉青靜;楊悅儉;王榮青;周國治;阮美穎;姚祝平;李志邈;萬紅建
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發明涉及用分子生物學方法對病毒進行定性、定量檢測的引物和探針，特別是涉及用實時熒光定量PCR（Real-time?fluorescence?quantitative?PCR,?FQ-PCR）技術對番茄黃化曲葉病毒進行定性、定量檢測的引物、TaqMan探針和試劑盒。?

背景技術

番茄（Lycopersicon?esculentum?Mill.）是世界上重要的蔬菜作物，其品種多，營養豐富，用途廣泛。病害的流行和逆境條件會限制番茄生產的發展。番茄黃化曲葉病毒病是制約番茄生產的重要病害之一，該病害引起番茄植株生長緩慢或停滯，開花結果困難，果型小等癥狀，致使番茄產量和質量嚴重降低，該病害是由雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的番茄黃化曲葉病毒(Tomato?yellow?leaf?curl?virus，TYLCV)引起的，并通過煙粉虱（Bemisia?tobaci）傳播，隨著煙粉虱在世界各地的擴展、農業耕作制度的改變、貿易活動的迅速發展以及氣候的變化，番茄黃化曲葉病毒在世界范圍內大面積爆發流行，目前已在中美洲、非洲、加勒比海地區、美國的加州和佛羅里達州、中東、地中海地區、東南亞地區、墨西哥、印度、澳大利亞、日本及中國等眾多的地區和國家發生（葉青靜，楊悅儉，王榮青，李志邈，阮美穎，周國治，姚祝平，番茄抗黃化曲葉病育種研究進展，中國農業科學,?2009，42(4):1230-1242）。?

番茄黃化曲葉病毒的危害在全球范圍內日益猖獗，為了控制這類病毒，對其進行檢測。常用的檢測方法有血清學方法、分子生物學方法和生物學檢測法。生物學檢測法是通過番茄表型癥狀來判斷是否感染發病，該方法受觀察的主觀性和癥狀產生的不確定性影響而具有一定的缺點。目前酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是應用最廣泛的血清學檢測方法，該方法抗血清制備需要時間較長，經常存在假陽性反應，并且很難檢測出早期的病毒感染。而分子生物學方法在敏感性和檢測速度上明顯提高，而且可以進行定量。?

PCR技術具有特異性強、快速、準確等特點，在病原體檢測、疾病診斷、法醫學鑒定等方面得到了廣泛的應用，并且是分子生物學領域常規的方法和手段。PCR技術自1985年建立以來，不斷得到改進，1996年，美國Applied?Biosystems?公司推出了實時熒光定量PCR（Real-time?fluorescence?quantitative?PCR,?FQ-PCR）技術，該技術是在常規PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術，是指在PCR反應體系中加入引物對的同時加入特異性熒光探針（TaqMan?探針），探針與模板特異性結合，其結合位點位于引物對之間，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程。實時熒光定量PCR技術具有更強的特異性、自動化程度高、無EB污染等特點，是快速分子診斷的發展趨勢。?

PCR技術為快速、準確地檢測番茄植株和介體煙粉虱體內的TYLCV提供技術支持，對快速檢測番茄黃化曲葉病毒暴發病情具有重要意義。?

發明內容

本發明目的是提供用于對番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）進行定性、定量檢測的引物。?

本發明所提供的引物，其上游引物堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO：1?所示，下游引物堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO：2?所示。?

序列表中的SEQ?ID?NO：1由23個堿基組成，該序列為番茄黃化曲葉病毒（TYLCV-CH；JF414236.1）基因自5’端第856-878位堿基的反向互補序列，SEQ?ID?NO：2由18個堿基組成，該序列為TYLCV基因自5’端第756-773位堿基，擴增片段長度為123bp。?

由上述引物衍生的引物序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQ?ID?NO：1和/或SEQ?ID?NO：2的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。?

上述引物既適用于番茄黃化曲葉病毒的實時熒光定量PCR檢測，也可用于該病毒的常規PCR檢測，其檢測對象是TYLCV基因。用上述引物對待測樣品進行PCR擴增，擴增產物有123bp大小的條帶，則樣品中含有TYLCV。?

本發明還提供了用于對TYLCV進行定性、定量檢測的TaqMan探針。?

本發明所提供的TaqMan探針，其DNA序列如序列表中SEQ?ID?NO：3?所示；所述探針是經過熒光標記的，其5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。?