[發(fā)明專利]焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110305109.2
• 申請(qǐng)日: 2011-10-11
• 公開（公告）號(hào): CN103045717A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭瑞娟;胡忠義;朱長(zhǎng)太;周燕;王潔;秦蓮花
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市肺科醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12R1/32
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

1.一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟：

步驟1，對(duì)rpoB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟2，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，判斷rpoB基因是否具有突變位點(diǎn)；其中焦磷酸測(cè)序采用SQA模式、核苷酸加樣順序?yàn)锳GCT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)rpoB基因RRDR區(qū)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述焦磷酸測(cè)序過程中，針對(duì)rpoB基因507~515位點(diǎn)和516~531位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸以A、G、C、T順序循環(huán)加樣16次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)rpoB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，其中第一次擴(kuò)增以痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴(kuò)增以第一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物為模板。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一次擴(kuò)增使用的第一PCR引物具有SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示序列，所述第二次擴(kuò)增使用的第二PCR引物具有SEQ?ID?NO.3所示序列或帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ?ID?NO.2所示序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR引物和第二PCR引物的濃度為0.4μmol/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在焦磷酸測(cè)序中用的測(cè)序引物具有SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)過程包括下列順序步驟：

步驟1：在94℃下進(jìn)行預(yù)熱5分鐘；

步驟2：在95℃下保持30秒進(jìn)行變性、65℃下保持30秒進(jìn)行退火、72℃下保持30?秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸，循環(huán)該過程40次；

步驟3：在72℃下保持10分鐘。