[發(fā)明專利]焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201110305109.2 | 申請(qǐng)日: | 2011-10-11 |
| 公開(公告)號(hào): | CN103045717A | 公開(公告)日: | 2013-04-17 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 鄭瑞娟;胡忠義;朱長(zhǎng)太;周燕;王潔;秦蓮花 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 上海市肺科醫(yī)院 |
| 主分類號(hào): | C12Q1/68 | 分類號(hào): | C12Q1/68;C12R1/32 |
| 代理公司: | 上海新天專利代理有限公司 31213 | 代理人: | 王敏杰 |
| 地址: | 200433 *** | 國(guó)省代碼: | 上海;31 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 磷酸 技術(shù) 檢測(cè) 結(jié)核 分枝桿菌 利福平 耐藥性 方法 | ||
1.一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法,其特征在于,包括以下順序步驟:
步驟1,對(duì)rpoB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增;
步驟2,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,判斷rpoB基因是否具有突變位點(diǎn);其中焦磷酸測(cè)序采用SQA模式、核苷酸加樣順序?yàn)锳GCT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,對(duì)rpoB基因RRDR區(qū)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述焦磷酸測(cè)序過程中,針對(duì)rpoB基因507~515位點(diǎn)和516~531位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述核苷酸以A、G、C、T順序循環(huán)加樣16次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述對(duì)rpoB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增,其中第一次擴(kuò)增以痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板,第二次擴(kuò)增以第一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物為模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述第一次擴(kuò)增使用的第一PCR引物具有SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示序列,所述第二次擴(kuò)增使用的第二PCR引物具有SEQ?ID?NO.3所示序列或帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ?ID?NO.2所示序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一PCR引物和第二PCR引物的濃度為0.4μmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在焦磷酸測(cè)序中用的測(cè)序引物具有SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增反應(yīng)過程包括下列順序步驟:
步驟1:在94℃下進(jìn)行預(yù)熱5分鐘;
步驟2:在95℃下保持30秒進(jìn)行變性、65℃下保持30秒進(jìn)行退火、72℃下保持30?秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸,循環(huán)該過程40次;
步驟3:在72℃下保持10分鐘。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息,商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于上海市肺科醫(yī)院,未經(jīng)上海市肺科醫(yī)院許可,擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購(gòu)買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作,請(qǐng)聯(lián)系【客服】
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