[發明專利]焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的方法

有效

• 申請號: 201110305109.2
• 申請日: 2011-10-11
• 公開（公告）號: CN103045717A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 鄭瑞娟;胡忠義;朱長太;周燕;王潔;秦蓮花
• 申請（專利權）人: 上海市肺科醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/32
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

1.一種焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟：

步驟1，對rpoB基因進行PCR擴增；

步驟2，對PCR擴增產物進行焦磷酸測序，判斷rpoB基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序為AGCT。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對rpoB基因RRDR區進行焦磷酸測序。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述焦磷酸測序過程中，針對rpoB基因507~515位點和516~531位點設計引物。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸以A、G、C、T順序循環加樣16次。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述對rpoB基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標本結核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產物為模板。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增使用的第一PCR引物具有SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示序列，所述第二次擴增使用的第二PCR引物具有SEQ?ID?NO.3所示序列或帶有生物素標記的具有SEQ?ID?NO.2所示序列。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR引物和第二PCR引物的濃度為0.4μmol/L。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示序列。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增反應過程包括下列順序步驟：

步驟1：在94℃下進行預熱5分鐘；

步驟2：在95℃下保持30秒進行變性、65℃下保持30秒進行退火、72℃下保持30?秒進行擴增和延伸，循環該過程40次；

步驟3：在72℃下保持10分鐘。