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[發明專利]焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的方法有效

專利信息
申請號: 201110305109.2 申請日: 2011-10-11
公開(公告)號: CN103045717A 公開(公告)日: 2013-04-17
發明(設計)人: 鄭瑞娟;胡忠義;朱長太;周燕;王潔;秦蓮花 申請(專利權)人: 上海市肺科醫院
主分類號: C12Q1/68 分類號: C12Q1/68;C12R1/32
代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213 代理人: 王敏杰
地址: 200433 *** 國省代碼: 上海;31
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 磷酸 技術 檢測 結核 分枝桿菌 利福平 耐藥性 方法
【權利要求書】:

1.一種焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的方法,其特征在于,包括以下順序步驟:

步驟1,對rpoB基因進行PCR擴增;

步驟2,對PCR擴增產物進行焦磷酸測序,判斷rpoB基因是否具有突變位點;其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序為AGCT。

2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,對rpoB基因RRDR區進行焦磷酸測序。

3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,所述焦磷酸測序過程中,針對rpoB基因507~515位點和516~531位點設計引物。

4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述核苷酸以A、G、C、T順序循環加樣16次。

5.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述對rpoB基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增,其中第一次擴增以痰標本結核桿菌DNA提取物為模板,第二次擴增以第一次擴增PCR產物為模板。

6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述第一次擴增使用的第一PCR引物具有SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示序列,所述第二次擴增使用的第二PCR引物具有SEQ?ID?NO.3所示序列或帶有生物素標記的具有SEQ?ID?NO.2所示序列。

7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一PCR引物和第二PCR引物的濃度為0.4μmol/L。

8.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示序列。

9.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述擴增反應過程包括下列順序步驟:

步驟1:在94℃下進行預熱5分鐘;

步驟2:在95℃下保持30秒進行變性、65℃下保持30秒進行退火、72℃下保持30?秒進行擴增和延伸,循環該過程40次;

步驟3:在72℃下保持10分鐘。

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