[發明專利]用于哺乳動物唾液腺上皮細胞和唾液腺干細胞培養的無血清培養液

有效

• 申請號: 201110303107.X
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102399742A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 張雁;汪華
• 申請（專利權）人: 東莞中山大學研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

技術領域

本發明涉及細胞生物學研究領域，尤其涉及哺乳動物唾液腺上皮細胞和唾液腺干細胞培養技術領域。

背景技術

唾液腺是哺乳動物的重要外分泌腺之一，其分泌物可以幫助消化、保護黏膜及抗菌抑菌。唾液腺的主要功能是產生和分泌唾液，正常情況下，人每天唾液分泌量約1升至1.5升。唾液的25％由腮腺分泌，5％由舌下腺分泌，10％由各種小涎腺(唇腺、頰腺、腭腺等)分泌，60％由下頜下腺分泌。目前已從動物及人的頜下腺發現或分離出近30種生物活性多肽，如神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、內皮生長刺激因子(EGSF)、紅細胞生成素(EPO)、骨髓克隆刺激因子(CSF)、腎素(renin)、激肽釋放酶(kallikrein，kk)、生長抑素、胰島素、淀粉酶、酸性磷酸酶、核糖核酸酶和酯肽酶等。這些多肽物質或直接分泌入血，或隨唾液進入消化道再由胃腸吸收入血，對多種組織和細胞的生理活動起重要調節作用。

唾液腺的實質部分由腺泡和導管組成。腺泡是腺體的分泌部，由單層腺上皮細胞圍繞而成。導管是排泄分泌物的管道，由導管上皮細胞構成。現有的研究成果顯示，唾液腺干細胞很有可能存在于導管部位。因此唾液腺上皮細胞是形成腺體、分泌和排泄唾液的重要功能細胞，唾液腺上皮細胞的功能異常，將會導致多種唾液腺疾病：(1)隨著年齡的增長，腺體的腺泡部分萎縮，導致簡直纖維性變和脂肪細胞增多，唾液流量減少。這種脂肪細胞增多是腺泡萎縮后的一種替代現象；(2)米古利茲氏病、舍格林氏綜合征(口干綜合征)。這是唾液腺的自身免疫性疾病，淋巴細胞浸潤并取代腺泡；(3)頭頸部腫瘤患者在接受放射性治療后，唾液腺上皮細胞受到損傷，唾液的分泌也會顯著減少，影響患者的生存質量；(4)唾液腺上皮細胞發生惡變形成腫瘤，如多形性腺瘤、腺樣囊性癌等。腫瘤細胞影響唾液腺的正常機能，但這些疾病的發病機理尚不清楚。因此，明確唾液腺上皮細胞的生物學特性，可以幫助在治療中避免損傷正常唾液腺，并利用唾液腺干細胞修復唾液腺組織及其功能。

唾液腺上皮細胞是研究唾液腺的重要材料，體外培養唾液腺上皮細胞和唾液腺干細胞是本研究領域的重要環節。以往的唾液腺上皮細胞培養液中添加有血清。血清中的復雜成分掩蓋了唾液腺上皮細胞的真實特性，并加速了唾液腺上皮干細胞的分化，細胞無法長期培養和繼代。近幾年市面上出售了進口的角化上皮細胞無血清培養液，有少數報道提示，這種培養液可以培養唾液腺上皮細胞，并可繼代3-4次。2008年Lombaert等人報道了用無血清細胞培養液培養小鼠頜下腺上皮細胞(I.M.Lombaert，J.F.Brunsting，P.K.Wierenga，H.H.Kampinga，G.de?Haan?and?R.P.Coppes，Keratinocyte?growth?factor?prevents?radiation?damage?to?salivary?glands?by?expansion?of?the?stem/progenitor?pool，Stem?Cells?26(2008)，2595-2601)，他們在DMEM/F12基礎培養基中添加了表皮細胞生長因子EGF(20ng/mL)，成纖維細胞生長因子FGF2(20ng/mL)，商品化產品N2(1/100)，胰島素(10μg/mL)和地塞米松(1μM)。N2是一種商品化產品，其組分不明確，而且價格昂貴。EGF和FGF2也是高價格商品，因此本領域迫切需要一種成本低廉、應用性強、適用于唾液腺上皮細胞和干細胞的無血清細胞培養液。一方面能夠保證實驗過程中唾液腺上皮細胞的穩定生長，另一方面，能夠獲得唾液腺干細胞。

發明內容

本發明的目的就是提供一種用于哺乳動物唾液腺上皮細胞和唾液腺干細胞培養的無血清培養液及其配制方法和使用方法。

為實現上述目的，本發明提供了一種無血清培養液，是在基礎培養基中添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩沖液、激素類化合物、轉金屬蛋白、抗氧化劑、血清白蛋白、糖類、嘌呤、嘧啶堿類物質以及pH值指示劑。

基礎培養基是MCDB153HAA；或三種培養基MCDB153HAA培養基、高糖DMEM和RPMI1640三者混合的培養基；具體的，可以是在MCDB153HAA基礎培養基中，添加1/20(v/v)的高糖DMEM和1/20(v/v)的RPMI1640培養基調配而成，上述該培養基是一種適合上皮細胞生長的培養基。