[發(fā)明專利]一種從重組蛋白制品中提取殘留DNA的磁珠法

有效

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• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN103031300A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱紅枚;王少雄;王洪芳;呂品
• 申請（專利權(quán)）人: 嘉和生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海天翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 王裕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從重組蛋白制品中提取殘留DNA的磁珠法。

背景技術(shù)

隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，越來越多的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，比如：單克隆抗體、細(xì)胞因子、激素、生長因子、其它還有某些酶類、凝血因子等。涉及到的治療領(lǐng)域也越來越廣泛，包括內(nèi)分泌、心腦血管、外科、血液病、抗腫瘤等等。重組蛋白制品的用量隨著臨床治療效果的需求也越來越大，由微克級上升到了毫克甚至克級。需長期重復(fù)用藥的生物產(chǎn)品也越來越多。這使得我們技術(shù)審評部門不得不更加重視由于DNA殘留所帶來的安全性擔(dān)憂。

自從上世紀(jì)80年代末，利用雜交瘤技術(shù)和重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的鼠源性單克隆抗體在各國被批準(zhǔn)使用，管理當(dāng)局就已經(jīng)認(rèn)識到這類產(chǎn)品的安全性問題。理論上，存在于生物制品中的微量的外源DNA雜質(zhì)，都有可能傳遞與腫瘤或病毒相關(guān)的基因，并導(dǎo)致癌變或其它病理變化。當(dāng)殘留的DNA與制品一同注射到人體后，含有致癌基因的細(xì)胞DNA就可能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生；如果含有某些可以整合的病毒的DNA，這種DNA還可以進(jìn)入宿主細(xì)胞，表達(dá)后感染受體，導(dǎo)致一系列的不良后果。

鑒于外源DNA對機(jī)體所具有的潛在危害，各國藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)對生物制品中殘留DNA的態(tài)度都十分謹(jǐn)慎，對生物制品中外源DNA殘留量有著嚴(yán)格的限度控制，同時(shí)要求生物制藥企業(yè)建立殘留DNA檢測方法，用于監(jiān)測并驗(yàn)證純化工藝去除該雜質(zhì)的能力，及終產(chǎn)品殘留DNA的檢測與產(chǎn)品放行。美國FDA及我國SFDA均規(guī)定采用連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)的純化生物制品中宿主DNA殘留量不得超過100pg/劑。

目前，已有的殘留DNA檢測方法主要包括固相斑點(diǎn)雜交法、熒光法、DNA結(jié)合蛋白法及q-PCR法等。雜交法雖然價(jià)廉易得，但其僅為一限量方法，實(shí)驗(yàn)周期較長、步驟繁瑣，有被其他方法取代的趨勢。而其他3種定量方法又以q-PCR法為優(yōu)，因其具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、快速且可實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)點(diǎn)，該法正越來越被廣泛應(yīng)用于殘留DNA的檢測。采用q-PCR法需先提取樣品中的殘留DNA，而DNA的提取效率將直接影響后續(xù)的定量結(jié)果，因此，DNA的提取效率成為衡量該法準(zhǔn)確度的重要指標(biāo)之一。DNA提取效率常用DNA的回收率來表示，即先向樣品中添加已知量DNA，再對樣品中DNA進(jìn)行提取和定量，通過計(jì)算DNA實(shí)際提取量與DNA已知量的比值得到DNA回收率。對于一個(gè)準(zhǔn)確穩(wěn)定的DNA提取方法，SFDA要求DNA回收率應(yīng)在70％-130％之間。

傳統(tǒng)的DNA提取方法苯酚-氯仿法，雖然成本較低，但步驟繁瑣、耗時(shí)長、DNA損失率高，難以實(shí)現(xiàn)從大量蛋白樣品中對痕量DNA的有效提取。磁珠法為一種新型的DNA提取方法，可以從復(fù)雜的基質(zhì)或樣品中提取DNA，同時(shí)還可以對DNA進(jìn)行濃縮，該方法方便快捷，整個(gè)實(shí)驗(yàn)僅需2-3小時(shí)即可完成。采用磁珠法提取重組蛋白制品中的DNA，其基本步驟及常規(guī)條件如下：

a)樣品準(zhǔn)備：低吸附離心管加入100μl樣品溶液，調(diào)節(jié)NaCl濃度至約0.5M，調(diào)節(jié)pH至7-8之間；

b)酶切：向離心管中加70μl蛋白酶K溶液(3mg/ml)，56℃孵育30min。

c)DNA結(jié)合：酶切后向離心管中加360μl裂解液、30μl磁珠及300μl異丙醇，高速振蕩5min，離心管快速離心15s，置于磁力架，靜置至溶液澄清后小心移走液體；

d)DNA清洗：加入300μl清洗液，輕微振蕩后快速離心，然后將離心管再放入磁力架，靜置至溶液澄清，小心移走液體，重復(fù)上述清洗步驟一次；

e)DNA洗脫：待離心管中磁珠揮發(fā)干后，加50μl洗脫液，70℃水浴7min，其間每隔2-3min將離心管取出迅速振蕩混勻，快速離心后，將離心管置于磁力架上，靜置2-3min，小心轉(zhuǎn)移液體至新的1.5ml離心管中，高速離心＞14000g、3min，再次將離心管放入磁力架，轉(zhuǎn)移DNA溶液至新的離心管中。

采用上述方法條件對常規(guī)樣品(如添加了DNA的高濃度BSA溶液或緩沖液)中的DNA進(jìn)行提取，即使添加的DNA量僅4pg，其回收率仍能達(dá)到70％以上。然而同樣的方法條件對重組蛋白制品，特別是高濃度的重組蛋白制品中DNA進(jìn)行提取時(shí)，即使添加的DNA量高達(dá)40pg，所得的DNA回收率也不足30％，準(zhǔn)確度無法達(dá)到相關(guān)法規(guī)要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題：采用現(xiàn)有磁珠法提取重組蛋白制品中DNA時(shí)DNA回收率偏低的問題。