[發(fā)明專利]表達(dá)乙型腦炎病毒PrM/M-E蛋白的重組BHK細(xì)胞系及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110302769.5
• 申請日: 2011-10-09
• 公開（公告）號: CN102337248A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華榮虹;步志高
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;A61K39/12;A61P31/14;G01N33/569
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組哺乳動物表達(dá)細(xì)胞系，具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)乙型腦炎病毒PrM/M-E蛋白重組BHK細(xì)胞系，更具體地，重組BHK細(xì)胞系是BHK-JEV-ME，其菌種保藏編號為：CGMCC?No.5263。本發(fā)明還公開了制備所述重組BHK細(xì)胞系的方法和該重組細(xì)胞系在制備預(yù)防乙型腦炎疫苗中的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)藥基因工程與免疫學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乙型腦炎又稱流行性乙型腦炎或日本乙型腦炎，是由乙型腦炎病毒引起的，侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒性人獸共患性傳染病。

流行性乙型腦炎(Epidemic?Encephalitis?B)又稱日本乙型腦炎(Japanese?BEncephalitis)，簡稱乙型腦炎。乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(Japanese?Encephalitis?virus，JEV)引起的一種重要蚊媒性人獸共患傳染病。多種動物易感，但通常只有人、馬和豬感染后會呈現(xiàn)臨床癥狀。人尤其是兒童對乙腦病毒易感，感染后臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)燒、劇烈頭痛、惡心、嘔吐、嗜睡不醒等，重者可出現(xiàn)抽搐、昏迷，甚至出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡。馬屬動物特別是幼駒易感，但多數(shù)呈隱性感染，少數(shù)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死亡率低，是終末宿主。豬是乙型腦炎病毒在自然界最重要的擴(kuò)增動物。懷孕母豬感染可導(dǎo)致死產(chǎn)和其他繁殖障礙，感染的公豬顯示睪丸急性炎癥。此病的地理分布主要在亞洲東部和亞洲南部，俄羅斯東部和太平洋島嶼等諸國也有報道。在世界范圍內(nèi)，每年約有35,000至50,000人感染發(fā)病，約有10,000例死亡病例。對人畜的健康造成嚴(yán)重的威脅。由于疫苗的成功應(yīng)用，乙型腦炎在我國已經(jīng)得到較好的控制，但近年來發(fā)病率有所上升，少數(shù)地區(qū)還有重要的疫情流行發(fā)生，如2006年山西運(yùn)城市發(fā)生嚴(yán)重的乙腦疫情。

采用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種是控制該病流行的有效措施。目前國際上認(rèn)可的乙型腦炎疫苗有乙型腦炎病毒中山株的鼠腦組織滅活疫苗，該疫苗價格較貴，免疫持續(xù)期不穩(wěn)定，且有免疫接種副反應(yīng)，安全性不是很好。其它疫苗還有包括用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的滅活疫苗，我國科研人員培育的乙型腦炎病毒減毒株(SA14-14-2株)制成的乙型腦炎病毒減毒活疫苗，但該疫苗的生物安全性和生產(chǎn)工藝等還沒有得到國際標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)可，從而限制了該疫苗在乙腦流行的其它國家的應(yīng)用。所以研制新型乙型腦炎疫苗勢在必行。基因工程疫苗是乙型腦炎疫苗新的發(fā)展方向。乙型腦炎病毒表面囊膜糖蛋白E蛋白是該病毒誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要蛋白。M蛋白在病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)中也起著得要作用。病毒樣顆粒(VLP)疫苗是新型基因工程疫苗，VLP具有與病毒粒子本身一樣的空間結(jié)構(gòu)，能產(chǎn)生與真實(shí)病毒一樣的免疫保護(hù)效果，但VLP為復(fù)制缺陷型，不含核酸，所以不存在毒力與致病等風(fēng)險。VLP與常規(guī)疫苗相比較更為有效，安全，是今后基因工程疫苗發(fā)展的重要方向。

乙型腦炎病毒屬黃病毒科黃病毒屬，為單鏈正義RNA病毒，病毒基因組長約11kb。整個基因組由5’端非編碼區(qū)(5’-NCR)、一個大的開放閱讀框(ORF)及3’端非編碼區(qū)(3’-NCR)構(gòu)成，無亞基因組結(jié)構(gòu)。ORF大小約為10.3kb，編碼一個多聚蛋白前體，經(jīng)切割加工，產(chǎn)生3個結(jié)構(gòu)蛋白：核心蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)和囊膜糖蛋白(E)；7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5)。不同毒株的JEV常在毒力與血凝特性上有明顯的差異，但沒有明顯的抗原性差異，即抗原變異不顯著。而且JEV感染或免疫可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的持久免疫力，迄今沒有見到臨床病例在痊愈后第二次感染發(fā)病的報道。這些特點(diǎn)為乙型腦炎的免疫預(yù)防提供了良好的基礎(chǔ)。在JEV編碼的3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白中，與機(jī)體的免疫保護(hù)反應(yīng)相關(guān)的蛋白主要是E蛋白和NS1蛋白。其中E蛋白的免疫保護(hù)機(jī)制主要是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體。

E蛋白是病毒粒子表面最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其表面的抗原決定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白與病毒的毒力、宿主范圍、組織嗜性、膜融合、保護(hù)性免疫、血凝反應(yīng)和血清特異性有關(guān)。E蛋白是乙型腦炎病毒最重要的免疫保護(hù)性抗原，它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和活性抗體。研究表明，基因工程表達(dá)的E蛋白，重組病毒表達(dá)的E蛋白以及包含E蛋白基因的DNA疫苗都具有很好的免疫保護(hù)作用。而且這種免疫保護(hù)作用主要是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體而發(fā)揮作用的。