[發明專利]優化的斑馬魚卵黃蛋白原基因及其表達載體和應用

無效

• 申請號: 201110301261.3
• 申請日: 2011-10-08
• 公開（公告）號: CN102352362A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 韓志華;趙慶新;成秀梅;單正軍;焦少俊
• 申請（專利權）人: 環境保護部南京環境科學研究所;鹽城師范學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C07K16/18
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種人工改造合成的編碼完整的斑馬魚(Danio?rerio)卵黃蛋白原VTG的新基因nvtg1以及依其構建的表達質粒及其含該表達質粒的工程菌，屬于遺傳工程領域。

技術背景

雌激素(Estrogen)可分為內源性雌激素和外源性雌激素，內源性雌激素主要指人體卵巢合成分泌的激素，而外源性雌激素也叫環境雌激素，它們可以進入生物體內，通過干擾生物體內源性雌激素的合成、分泌、轉運、結合、活性反應、代謝、消解或產生類似生物體內源性雌激素的作用。環境雌激素種類很多，主要包括人工合成雌激素、植物性雌激素、真菌性雌激素、有激素效應的環境化學污染物等等。環境雌激素污染已經成為一個嚴重的環境問題和社會問題。

一些研究環境雌激素生態毒性的動物模型的建立，如斑馬魚(Danio?rerio)，唐魚等，對環境雌激素污染的研究和監控具有重要的意義。雌激素的體內信號通路的研究使人們認識到卵黃蛋白原(Vitel?logenin，VTG)等蛋白是是雌激素和雌激素受體(Estrogen?receptors，ER)調控的下游蛋白，因此VTG可以作為一種重要的、可反應雌激素水平的生物標志物。

檢測環境雌激素污染模式生物體內的VTG蛋白含量需要有效的定量和定性研究的技術，其具體使用的蛋白檢測方法為Western?Blot和Elisa，Western?Blot和Elisa的使用的前提條件是需要有VTG蛋白標品。目前，VTG蛋白標品主要來自模式生物的天然VTG蛋白(natural?VTG，nVTG)，但其天然含量少，給分離純化帶來很大的難度，而使用基因工程重組技術生產VTG(recombinant?VTG，rVTG)是先進而有效的方法。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種人工改造合成的，可在大腸桿菌中高效表達的編碼完整的斑馬魚卵黃蛋白原VTG的新基因nvtg1，該人工改造合成的nvtg1基因，具有SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列。

所述核苷酸序列使用了大腸桿菌偏愛性密碼子。

使用所述斑馬魚卵黃蛋白原VTG基因nvtg1構建的表達質粒屬于本發明的保護范圍。

所述表達載體為胞內表達載體，優選以pET-28a(+)為骨架。

使用所述斑馬魚卵黃蛋白原VTG基因nvtg1或表達載體構建的轉基因細胞系或基因工程菌均屬于本專利的保護范圍。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種所述斑馬魚卵黃蛋白原VTG基因nvtg1或含有斑馬魚卵黃蛋白原VTG基因nvtg1的表達載體在環境檢測，食品檢測、醫學研究和VTG抗體制品生產中的應用。

本發明設計并合成了編碼斑馬魚卵黃蛋白原的新基因nvtg1，構建了適用于魚卵黃蛋白原表達的工程菌。表達結果表明，VTG蛋白產量可以達到3mg/ml，Western實驗表明其抗原性顯著，實現了VTG蛋白在原核生物大腸桿菌中高效率表達，適合工業化生產。

附圖說明

圖1nvtg1/pET28a(+)物理圖譜

圖2重組表達VTG的SDS-PAGE圖譜和Western圖譜

a.重組表達rVTG的SDS-PAGE

1.蛋白Marker；2.雌性斑馬魚VTG樣品；3.pET-28a(+)/BL21(DE3)的胞內沉淀；3.未用IPTG誘導的nvtg1/pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；4.未用IPTG誘導的nvtg1/pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；nVTG代表天然的VTG蛋白；rVTG代表重組表達的VTG蛋白。

b.重組表達rVTG的Western鑒定

1.蛋白Marker；2.雌性斑馬魚VTG樣品；3.pET-28a(+)/BL21(DE3)的胞內沉淀；3.未用IPTG誘導的nvtg1/pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；4.未用IPTG誘導的nvtg1/pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；nVTG代表天然的VTG蛋白；rVTG代表重組表達的VTG蛋白。

具體實施方式

以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。

實施例1?nvtg1基因設計