[發(fā)明專利]鉑類藥物療效相關(guān)基因SNP檢測(cè)特異性序列和液相芯片

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110301102.3
• 申請(qǐng)日: 2009-06-09
• 公開（公告）號(hào): CN102312007A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許嘉森;楊惠夷;何嘉英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州益善生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及鉑類藥物療效相關(guān)基因ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1的SNP檢測(cè)的特異性序列和液相芯片。

背景技術(shù)

自從1967年順鉑的抗癌活性被發(fā)現(xiàn)以來，鉑類抗癌藥物的研究和應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。目前已發(fā)展出以卡鉑為代表的第二代，和以奧沙利鉑為代表的第三代鉑類藥物。鉑類是目前常用的廣譜抗腫瘤藥，已成為癌癥化療中不可缺少的藥物。鉑類藥物的療效雖得到廣泛認(rèn)可，但患者用藥后藥效的個(gè)體差異很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系統(tǒng)毒性，常見為惡心、嘔吐，還可有腎毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神經(jīng)毒性較輕。

鉑類藥物的抗腫瘤作用是通過作用于DNA，形成Pt-DNA結(jié)合物，導(dǎo)致DNA的鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成及復(fù)制。大量的臨床研究已經(jīng)證實(shí)，鉑類藥物的療效/毒副作用與患者體內(nèi)四個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)關(guān)系密切，即ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1。ERCC1和ERCC2都是DNA核苷酸切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因，XRCC1是DNA堿基切除修復(fù)途徑中的重要因子。GSTP1是一種谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，它通過將有毒物質(zhì)的親電子基團(tuán)與谷胱甘肽結(jié)合，起到保護(hù)細(xì)胞大分子的作用。這四個(gè)基因通過參與DNA修復(fù)等生理過程，使受鉑類化合物破壞的DNA回復(fù)正?；蚴笵NA免受破壞，在腫瘤細(xì)胞中造成耐藥，而在正常細(xì)胞中則能夠減少毒副作用。因此，專家推薦患者在接受鉑類化療之前，進(jìn)行相關(guān)的基因SNP檢測(cè)，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè)體差異制定個(gè)體化用藥方案。這樣將明顯提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。

大量臨床研究顯示，最常見的造成這四個(gè)基因功能減弱的多態(tài)性位點(diǎn)分別是ERCC1的C19007T和C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G。在中國(guó)人群中，ERCC1-C19007T、ERCC1-C8092A、ERCC2-A2282C和XRCC1-G1301A的基因分布頻率分別約為21％、24％、5％和30％；GSTP1-A1578G基因分布頻率約21％。大量研究表明，在ERCC1、ERCC2、XRCC1這三個(gè)基因中攜有一個(gè)或以上功能減弱等位基因型的患者，在接受鉑類化療時(shí)，發(fā)生毒副作用的幾率明顯升高，以致治療效果較差。而GSTP1-A1578G基因多態(tài)性位點(diǎn)的情況正好相反，遺傳基因型為GA或GG的患者，在接受鉑類化療時(shí)，對(duì)鉑類藥物的反應(yīng)率較高、有較好的療效。因此，通過對(duì)這五個(gè)常見功能SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)患者的基因型判斷是否采用鉑類藥物或制定個(gè)體化用藥方式，將能明顯提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。

目前已建立了若干以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的技術(shù)，如直接測(cè)序法，半定量PCR技術(shù)，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測(cè)，以上技術(shù)具有靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高等缺點(diǎn)。普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測(cè)通量的局限性不能滿足臨床的需要。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進(jìn)行一種SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，耗時(shí)費(fèi)力；傳統(tǒng)的固相芯片價(jià)格昂貴，而且敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差?；谛酒脑?，美國(guó)Luminex公司開發(fā)出了以微球?yàn)檩d體的懸浮液相芯片技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測(cè)儀作為檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測(cè)。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對(duì)不同待檢測(cè)物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報(bào)告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測(cè)物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測(cè)體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測(cè)，其中紅色激光檢測(cè)微球表面紅色分類熒光的強(qiáng)度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號(hào)分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測(cè)樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度，再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析激光所檢測(cè)到微球種類、數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本多種目標(biāo)測(cè)試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測(cè)的要求，同時(shí)具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。我們采用x-Taq液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)SNP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高通量快速簡(jiǎn)便化操作，大大提高了檢測(cè)效率，在同類檢測(cè)技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。

發(fā)明內(nèi)容