[發明專利]一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白、試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201110300230.6
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102432676A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 任瑞文;唐博恒;張培;洪文艷;于德憲
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍廣州軍區疾病預防控制中心
• 主分類號: C07K14/18
• 分類號: C07K14/18;C12N15/40;C12N15/70;G01N33/569
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種診斷登革病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，以及以該抗原蛋白作為包被抗原的登革病毒檢測試劑盒。?

背景技術

登革病毒(Dengue?virus，DV)隸屬黃病毒科，包括1～4個血清型，據世界衛生組織統計，目前全世界超過100個國家的25億人正受登革病毒威脅，每年感染人口多達5000萬～1億，其中有25～50萬人屬于嚴重的登革出血熱，平均死亡率為5％，是僅次于瘧疾的重要熱帶病。我國南方各省為登革熱高發區，監測表明，1990～2010年間我國每年都有登革熱流行，種種跡象表明我國已成為登革病毒的疫源地。因此，登革病毒的預防與控制日益緊迫。而該類病毒防制的關鍵在于及時發現，并盡早隔離，故而對登革病毒及時、有效地檢測對于該病的檢疫和防止具有非常重要的意義。目前國內外關于登革病毒檢測方法一般采取病毒分離、核酸檢測及免疫學檢測。其中病毒分離及核酸雜交法操作都較繁瑣，對儀器要求較高，而且其周期都較長，且病毒分離還受標本抽取時間、臨床用藥等因素的影響，達不到早期快速診治的目的，很難在實踐中得到應用；建立在PCR基礎上的快檢方法近年進展較快，但對設備及操作人員的要求較高，容易產生假陽性、假陰性結果。免疫學檢測主要包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)及膠體金等方法，速度快，對實驗要求不高，不需要無菌操作，可以自動化、高通量的檢測大量樣品，同時也比較靈敏、可靠，并且已經在不同的病原檢測中得到廣泛應用，其操作已被廣大基層衛生防疫人員熟練掌握，有其他方法無法代替的優勢。?

從現有技術中公開的登革病毒血清學診斷方面的資料來看，主要存在以下方面的問題：(1)不同黃病毒之間存在嚴重的血清學交叉反應，在那些存在多?種黃病毒流行的區域，由于混合感染，患者體內存在交叉抗體，使得免疫學診斷及鑒別診斷十分困難。(2)由于IgG抗體可以在宿主體內存在很長時間，有的還會超過10個月，甚至終生攜帶，使得鑒別過去、最近還是現在感染登革病毒十分困難。(3)登革病毒為小RNA病毒，具有較高的突變率，因此采用單抗原檢測時其覆蓋面往往受到限制。?

發明內容

有鑒于此，本發明的所解決的技術問題在于提供一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，該重組抗原蛋白具有特異性強、親和力高的優點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與登革病毒抗體具有極高親和力。?

本發明的所解決的技術問題在于提供一種登革病毒的檢測試劑盒，利用所制備的重組抗原蛋白，建立登革病毒抗體的ELISA快速檢測技術。?

為了解決上述技術問題，一方面，本發明提供一種檢測登革病毒的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白包括具有如SEQ?ID?NO.6所示氨基酸序列的Den-Ag5。?

優選地，所述Den-Ag5的編碼基因序列具有如SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列。?

優選地，所述重組抗原蛋白還包括具有SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的Den-Ag1和/或具有SEQ?ID?NO.4所示氨基酸序列Den-Ag2；所述Den-Ag1的編碼基因序列具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。?

進一步優選地，所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-Ag1、Den-Ag2等量混合而成。?

該重組抗原蛋白是通過選擇登革病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，并將相應的目的基因片段通過原核表達載體導入宿主細胞中進行表達而制備得到，而目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使?表達的重組抗原蛋白正確折疊。?

另一方面，本發明具體實施方式中還提供了一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟：?

一、選擇登革病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段包含如SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；?

二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；?

三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；?