[發(fā)明專利]基因工程用工具菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110300048.0
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102344897A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于浩洋
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇靜
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 孔青;李炳愛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及在分子克隆中可防止重復(fù)DNA序列重組的工具菌及其構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)

眾所周知，含有同源序列的兩個(gè)DNA序列之間可以發(fā)生交換重組，即同源重組。在基因工程領(lǐng)域，業(yè)已開發(fā)出多種同源重組技術(shù)以及許多工程菌用于各種各樣的基因操作。

1.Red/ET同源重組

Red/ET重組是上個(gè)世紀(jì)末發(fā)明的一種新型的基因工程技術(shù)。在Redα/Redβ或RecE/RecT重組酶系統(tǒng)的相互配合作用下，兩端帶有短同源臂(35～50bp)的供體DNA分子能直接重組到靶標(biāo)DNA分子上，實(shí)現(xiàn)對受體分子的取代、插入、缺失、突變等多種修飾。Red/ET重組對靶標(biāo)DNA快速、精確、高效的修飾，同源臂短，不受內(nèi)切酶位點(diǎn)和DNA片段大小限制的獨(dú)特優(yōu)勢，給基因工程領(lǐng)域帶來了又一場重大變革。該技術(shù)已經(jīng)在大腸桿菌(E.coli)染色體修飾、基因簇的克隆與修飾、質(zhì)粒的構(gòu)建、基因打靶載體的構(gòu)建等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

2.通過Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的位點(diǎn)特異性重組

來源于P1噬菌體的Cre重組酶是屬于位點(diǎn)特異性重組酶家族中的重要成員，它是一個(gè)大小為38KD的蛋白，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)(序列)之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組[Hamilton?DL等，JMol?Biol.1984，Vol.178，No.2，p.481-6]。Cre-LoxP重組系統(tǒng)的一個(gè)最大優(yōu)點(diǎn)是對于有效的重組作用不需要任何補(bǔ)充的輔助因子或者序列元件，以及不依賴細(xì)胞外環(huán)境。

3.大腸桿菌JM109野生型(WT)菌株

該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13噬菌體載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α-互補(bǔ)，從而顯示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。該菌基因型為：recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Δ(la-proAB)/F’[traD36，proAB，lacIq，lacZΔM15]。

4.大腸桿菌HS996、HS996-gyrA96和BG2005菌株

大腸桿菌HS996(Gene?Bridges?GmbH)在以往的BAC修飾和基因克隆中被用作宿主菌來使用。該菌基因型為：F-mcrA.(mrr-hsdRMS-mcrBC)lacX74?recA1?deoR?araD139.(ara-leu)7697?galU?galK?rpsL(Str^R)endA1?nupG?fhuA::IS2(賦予噬菌體T1抗性)。

大腸桿菌HS996-gyrA96菌株由于gyrA96基因突變可以產(chǎn)生針對萘啶酸的抗性，所以它是帶有萘啶酸抗性被優(yōu)化了的基因工程用菌。該菌基因型為：F-mcrA.(mrr-hsdRMS-mcrBC)lacX74?recA1?gryA?deoRaraD139.(ara-leu)7697?galU?galK?rpsL(Str^R)endA1?nupG?fhuA::IS2(賦予噬菌體T1抗性)。

大腸桿菌BG2005菌株是來源于經(jīng)優(yōu)化的HS996菌株，并且在此菌基礎(chǔ)上通過將rdd-alpha和recT兩個(gè)基因從基因組中缺失，從而被進(jìn)一步優(yōu)化了的基因工程用菌。它相對于HS996菌株具有非常明顯提高的DNA穩(wěn)定性的優(yōu)勢特性。該菌基因型為：F-mcrA.(mrr-hsdRMS-mcrBC)M15.lacX74?recA1?deoR?araD139.(ara-leu)7697?galU?galK?rpsL(Str^R)endA1nupG?fhuA::IS2(賦予噬菌體T1抗性)Δred-alphaΔrecT。

5.大腸桿菌BJ5183和DY380菌株

大腸桿菌BJ5183(源于Dr.Douglass?Hanahan)(Takahashi?N等，Gene.2003，Vol.303，p.89-97)的基因型為：recBC?sbcBC?endA?galk?met?thi-1?bioThsdR?Str^R。