[發(fā)明專利]一種基于量子點(diǎn)的單病毒示蹤方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110299128.9
• 申請(qǐng)日: 2011-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN102445541A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龐代文;劉書琳;張志凌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/58
• 分類號(hào): G01N33/58
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于量子點(diǎn)的單病毒示蹤方法，屬于化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

病毒侵染宿主細(xì)胞的過程非常復(fù)雜,往往包含許多階段、多種途徑并涉及不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。為了滿足抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)及基因治療方面的發(fā)展，病毒侵染機(jī)制的研究非常重要。單病毒示蹤技術(shù)是利用顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)控單個(gè)病毒或亞病毒結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為，研究病毒的侵染過程及病毒與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間相互作用，進(jìn)一步揭示未發(fā)現(xiàn)的生物機(jī)制的動(dòng)態(tài)成像技術(shù)。近幾年,單病毒示蹤技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于病毒侵染機(jī)制的研究領(lǐng)域，成為監(jiān)控病毒的侵染路徑或病毒的組分與宿主細(xì)胞相互作用一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

但是，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒粒子的熒光標(biāo)記成為進(jìn)行單病毒示蹤的首要條件。傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物存在易光漂、標(biāo)記效率低等缺點(diǎn)，不能滿足長(zhǎng)時(shí)間、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)可視的示蹤效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種可長(zhǎng)時(shí)間、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)可視化的單病毒示蹤方法。

為了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的單病毒示蹤，本發(fā)明以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物來標(biāo)記病毒，利用帶有在線培養(yǎng)裝置的轉(zhuǎn)盤式熒光共聚焦為成像儀器，通過兩步法的標(biāo)記策略，從而實(shí)現(xiàn)基于量子點(diǎn)的單病毒的長(zhǎng)時(shí)間示蹤。

具體的技術(shù)方案包括如下步驟：

1.??????利用生物素化的試劑盒，將病毒表面進(jìn)行生物素化修飾；

2?.利用病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合的作用，將生物素化的病毒吸附到細(xì)胞表面；

3.利用鏈酶親和素與生物素的相互作用，將鏈酶親和素化的量子點(diǎn)標(biāo)記到病毒表面；

4.利用帶有在線培養(yǎng)裝置的轉(zhuǎn)盤式熒光共聚焦為成像儀器，對(duì)病毒在活細(xì)胞內(nèi)的侵染行為進(jìn)行監(jiān)控。

本發(fā)明利用一種簡(jiǎn)單高效的基于量子點(diǎn)的病毒標(biāo)記策略，建立了一種基于量子點(diǎn)的長(zhǎng)時(shí)間的單病毒示蹤技術(shù)。量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物,具有獨(dú)特又優(yōu)越的光學(xué)性能,如消光系數(shù)大，量子產(chǎn)率高，激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄,亮度比傳統(tǒng)的熒光染料高10-100倍，光穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的熒光染料高100-1000倍等特點(diǎn)。該技術(shù)將成為各種病毒侵染機(jī)制的強(qiáng)有利工具。本發(fā)明可更廣泛地應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)等領(lǐng)域。

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附圖說明

圖?1?量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的流程示意圖。

圖?2在細(xì)胞表面量子點(diǎn)標(biāo)記的病毒。(左圖)?細(xì)胞的微分干涉相差圖片，(右圖)細(xì)胞表面量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的熒光照片。

圖3?H9N2亞型禽流感病毒在活細(xì)胞的軌跡。

圖4?H9N2病毒的速度與時(shí)間的關(guān)系曲線，標(biāo)尺20微米。

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具體實(shí)施方式???????????????????????????????

????下面對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的操作方法詳細(xì)說明。

1.??????將狗腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)在共焦專用的培養(yǎng)小皿中，24h后可以用于實(shí)驗(yàn)。

利用生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin（Thermo），通過與H9N2禽流感病毒表面的氨基將生物素連接到病毒表面。具體操作如下：取0.3mg生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin，加入到300?μL（蛋白濃度為400?mg/ml）的純化好的病毒溶液中，室溫?fù)u床反應(yīng)2h。多余的生物素化試劑利用NAP-5（GE?Healthcare）的脫鹽柱除掉多余的生物素化試劑，獲得體積為700?μL標(biāo)記好的病毒溶液。

2.???取100μL生物素化的病毒加入到細(xì)胞表面，4度孵育10min，用?1X?PBS緩沖溶液洗3次。

3.??????再加入100μL濃度為1nM的鏈霉親和素化的量子點(diǎn)(SA-QDs,?武漢珈源量子點(diǎn)有限公司)到細(xì)胞表面4度孵育10min，用PBS緩沖溶液洗3次。

4.???放在100X的共焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，獲得圖2。

5.???用高斯濾波出去背景噪音。

6.??利用圖像處理軟件對(duì)單個(gè)病毒在每一幀運(yùn)動(dòng)位置進(jìn)行獲取，得到病毒的運(yùn)動(dòng)軌跡（圖?3）。將病毒每幀的運(yùn)動(dòng)速度與相對(duì)時(shí)間做曲線，得到圖?4。該技術(shù)可以有效地長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒侵染機(jī)制的動(dòng)態(tài)研究。