[發(fā)明專利]一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110297625.5
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102337284A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李威;萬軍飛
• 申請（專利權(quán)）人: 生工生物工程(上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 上海脫穎律師事務(wù)所 31259
• 代理人: 李強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域，涉及一種基因工程中得以廣泛使用的DNA分子量標準(DNA?Marker)的生產(chǎn)方法。具體地，本發(fā)明涉及一種用于低成本快速生產(chǎn)高質(zhì)量DNA?Marker的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，同時涉及利用該質(zhì)粒生產(chǎn)DNA?Marker的方法與應(yīng)用。?

背景技術(shù)

基因工程又稱重組DNA技術(shù)，是指在體外在分子水平上對DNA進行切割、連接、修飾等一系列操作的過程，是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上綜合發(fā)展起來，誕生于20世紀70年代的一門嶄新的生物科學(xué)技術(shù)。盡管該技術(shù)是一門年輕的技術(shù)，但其在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域甚至是物理學(xué)、高分子科學(xué)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中起到了非常巨大的作用。?

在對DNA的體外操作中，涉及到DNA分子的分離、純化、切割、修飾、連接、擴增、序列測定等許多過程，其中，最基礎(chǔ)而且應(yīng)用非常廣泛的一項操作是DNA的電泳。DNA電泳是指利用DNA在中性緩沖液中帶負電的性質(zhì)，在一定的電場作用下，在特定的支持介質(zhì)中(比如瓊脂糖凝膠)，不同大小的DNA片段由于帶有的電荷量以及空間位阻等的不同而在支持介質(zhì)中具有不同的泳動速度從而得以分離的過程。DNA電泳是基因工程中最基本的技術(shù)，DNA制備、檢測、濃度測定、目的DNA片段的純化，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。?

在凝膠電泳中，在一定的范圍內(nèi)，具有相同構(gòu)型的DNA在相同的凝膠濃度和電場強度下，其遷移率與DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的長度)呈線性關(guān)系。因此，可以用一組分子量(長度)已知的DNA片段混合物來指示未知DNA分子的大小。這種由一組分子量已知的，電泳后按其分子量大小和遷移率的不同可以在凝膠上形成一個DNA片段分布梯度，從而可以指示電泳過程中未知DNA樣?品的分子量的DNA片段混合物就稱為DNA分子量標準，簡稱DNA?Marker。?

DNA?Marker的應(yīng)用非常廣泛，是分子生物學(xué)實驗室的常用試劑。盡管實現(xiàn)DNAMarker的原理非常簡單，但要制作低成本高質(zhì)量的DNA?Marker還是有相當?shù)碾y度。目前各實驗室中DNA?Marker的使用大部分是從商業(yè)公司購買，而且由于DNA?Marker是消耗品，每個實驗室中的使用量非常大，具有廣闊而良好的市場前景。目前，許多生物公司也為此開發(fā)了多種針對不同應(yīng)用的，具有不同分子量范圍的DNAMarker產(chǎn)品。?

DNA?Marker的制備上，目前主要有兩種方法：PCR法和酶切法。?

PCR法實現(xiàn)簡單，通過PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)強大的擴增能力，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)特定的模板設(shè)計特定的引物擴增出一系列不同大小的DNA片段，通過純化、定量和組合即形成了DNA?Marker。該方法的優(yōu)點是操作簡單、制作方便，各條帶的大小控制方便，不同大小的條帶可以靈活的組合成不同的DNAMarker。為了改善重復(fù)性和降低成本，目前的主流方法已經(jīng)由獲得單一的DNA片度PCR向多重PCR(多對引物針對同一模板或一對引物針對多個面板的情況)技術(shù)發(fā)展。但其仍然存在成本較高，長片段擴增困難或效率不高，條帶不夠銳利，條帶之間的亮度難以完全一致，重復(fù)性差等缺點。?

酶切法又分為以天然來源的基因組DNA的限制性酶切和基于人工構(gòu)建載體的限制性酶切。天然來源的基因組DNA酶切是指分離某種來源固定、背景信息清晰的基因組DNA分子，用一種或幾種限制性內(nèi)切酶進行消化，從而產(chǎn)生一系列DNA片段組合。用該方法生產(chǎn)的最經(jīng)典的DNA?Marker是Lambda?DNA/Hind?III?Marker，Lambda噬菌體基因組DNA經(jīng)過內(nèi)切酶Hind?III消化后，產(chǎn)生125bp至23130bp大小的8條條帶。用這種方法生產(chǎn)DNA?Marker制作方便，在DNA來源方便的情況下，成本也比較低。但其缺點也是顯然易見的：1、條帶距離不均勻，由于來自天然的基因組，DNA分子上的酶切位點的位置也是天然的，是不可控的，因此DNAMarker中有的兩個條帶之間相聚很遠，不能清晰地指示該區(qū)域內(nèi)的未知DNA分子量情況，有的兩個條帶之間距離很近，難以清晰地分開；2、基于同樣的原因，條?帶的分子量未能是整數(shù)；3、條帶亮度嚴重不均一，這也是最嚴重的問題，由于對應(yīng)片段在基因組中的拷貝數(shù)不可控，分子量大的條帶的亮度與分子量較小的條帶的亮度相差很遠，以Lambda?DNA/Hind?III?Marker為例，最大的條帶23130bp與最小的條帶125bp在亮度上要相差上百倍，電泳過程中往往導(dǎo)致大條帶未實現(xiàn)良好分離而小條帶已經(jīng)嚴重擴散導(dǎo)致亮度很低甚至不可見。?