[發明專利]一種用于擴增CIK的方法及一種CIK細胞制劑

有效

• 申請號: 201110297100.1
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102352342A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 張贊;蘇國新
• 申請（專利權）人: 上海柯萊遜生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/0786;A61K35/14;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 黃為

技術領域

本發明屬于免疫細胞體外培養領域，涉及一種用于擴增CIK的方法，所述CIK細胞為經由外周血單個核細胞(PBMC)擴增培養成細胞因子誘導的殺傷細胞，本發明還進一步的提供了一種CIK細胞制劑。

背景技術

生物治療是通過調動宿主天然防衛機制或給予天然產生的靶向性很強的物質來達到臨床治療效果，生物治療領域中一個重要的方法就是免疫細胞療法，即將分離的自身免疫細胞在體外通過細胞因子誘導，擴增初大量具有高度細胞毒活性的異質細胞群(CIK)，再回輸至體內發揮治療作用。此類免疫細胞的種類包括了淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)，腫瘤侵潤淋巴細胞(TIL)，細胞毒淋巴細胞(CTL)，CD3單抗激活的殺傷細胞(CD3AK)及細胞因子誘導的殺傷細胞。在眾多的免疫細胞中，CIK細胞由于有殺瘤活性高，殺瘤譜廣，對多種耐藥細胞同樣敏感以及對正常骨髓造血前提細胞毒性更小等優良特點，廣泛的應用于臨床。

與其它免疫細胞相比，CIK細胞是已知的殺傷活性最強的效應細胞之一。它是通過加入多種細胞因子，由外周血單個核細胞培養而來的一群異質細胞，CIK細胞臨床治療效果主要取決于回輸細胞的數量和細胞毒活性。CIK細胞中最具細胞毒活性的是CD3+CD56+細胞(NKT細胞)，NKT細胞表面能夠同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性又具備NK細胞的非MHC限制性殺瘤的特點，然而NKT細胞在正常的外周血中含量極低，僅為1％左右。因此，在體外培養中，提高CIK細胞的絕對數量和其中的NKT細胞的比例對提高臨床治療效果至關重要。

CIK細胞能通過體外誘導而大量增殖，一般的CIK制備方法是將分離的外周血單個核細胞(PBMC)用IFN-γ處理24小時后，加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子進行刺激誘導，最終獲得一定數量的CIK細胞，但最終獲得的CIK細胞的增值倍數和細胞毒活性都不夠理想。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是常規CIK擴增方法所得到的CIK細胞增殖細胞倍數和細胞毒活性不夠理想的問題，并針對該問題提供一種用于擴增CIK的方法。

本發明通過以下技術方案解決上述問題：

一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，按如下程序實施：

a、應用淋巴細胞分離液分離出PBMC，將培養袋預先用CD3mAb和CD137mAb包被，將分離得到的PBMC用無血清培養基調整濃度之1×10⁶/ml，并加入IFN-γ至終濃度為1000u/ml，轉移至培養袋中培養；

b、培養24小時后加入CD3mAb、CD28mAb、CD137mAb，并加入配置的無血清培養基，配置的無血清培養基中添加了IL-1α、IL-2、IL-12及IL-15，連續培養7-21天后，離心收集獲得的CIK細胞；

c、b步驟的培養過程中，每隔3天對培養袋中的細胞進行計數，并根據細胞濃度補加培養基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb，CD137mAb至相應濃度。

與常規的培養方法相比，本發明的有益效果表現在以下幾方面：

第一，本發明所述用于擴增CIK的方法在a步驟采用了培養袋包被技術。試驗表明，附著的單抗比游離的單抗對細胞的促有絲分裂作用更強，從而有助于提高了細胞的擴增水平；

第二，在b步驟使用了多種單抗。在CIK的培養體系中，CIK細胞是通過誘導活化的T細胞分化而來，CD3mAb作為抗原刺激提供了T細胞活化的第一信號，而CD28mAb作為T細胞表面的共刺激分子與其配體結合，提供了T細胞活化的第二信號，試驗結果表明，共刺激分子的存在有利于增強T細胞的活化效果；而CD137/CD137L則是TNFR/TNF超家族成員之一，兩者結合后介導的共刺激信號同樣可刺激T細胞增殖，本發明所述用于擴增CIK的方法，在b步驟中同時加入了3種單抗，既相對降低了單個抗體的使用總量，又通過單抗相互間的協同作用刺激T細胞高通量地活化增殖，從而使收獲的CIK細胞數量有了大比例的提高；