[發明專利]一種用于大鼠胚胎干細胞的培養基

在審

• 申請號: 201110295293.7
• 申請日: 2011-09-29
• 公開（公告）號: CN103031272A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 諶兵來;曾橋;劉上峰;徐俊
• 申請（專利權）人: 諶兵來
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術領域

本發明涉及細胞培養領域。更具體地，本發明涉及用于大鼠胚胎干細胞培養的培養基及相應的培養方法。

背景技術

人類、小鼠、大鼠及許多動植物的基因測序已經完成，標志著生命科學研究已經開始邁進后基因組時代，即基因功能分析的時代。目前的基因功能分析方法有：基因敲除、反義技術、顯性失活、基因誘導超表達、RNA干涉以及生物信息學等，其中以基因敲除方法為基因功能分析最為標準的方法，基因敲除分析已成為基因功能分析的金標準。

模式生物(包括基因敲除大鼠及小鼠)將在功能基因組學研究中發揮無可替代的重要作用。在國外，小鼠、大鼠、果蠅、線蟲及爪蟾等一直是生物學研究中不可缺少的模式生物，利用這些模式生物所作的研究直接催生了多項諾貝爾獎。利用敲除技術研制的遺傳修飾小鼠可用于研究基礎生物學課題，用作人類疾病模型、藥物篩選和治療方案評價，在基礎研究和應用研究方面具有極其重要的價值。遺憾的是，與生物信息學、生物芯片、蛋白質組學等功能基因組學相比，模式生物相關領域的研究在國內沒有受到足夠的認同和重視，相關的基礎研究還相當薄弱，正成為妨礙國內功能基因組學向更深層次進一步發展的瓶頸。

目前基因敲除技術最常使用的動物模型為小鼠，主要包括完全基因敲除和條件型基因敲除。同源重組基因敲除的關鍵是獲得具有生殖功能的胚胎干細胞。

1981年，英國科學家馬丁·埃文斯成功提取了小鼠的胚胎干細胞，可以讓科學家在小鼠體外進行基因操作，確定特定基因在發育、生理和病理過程中的作用。此后科學家轉入研究大鼠，因為相比與小鼠，大鼠的解剖學和生理學特征與人類更加接近，但由于小鼠胚胎干細胞的提取和培養方法無法套用到大鼠身上，20多年沒有突破。

要想獲得大鼠基因敲除模型，其中的關鍵就在于建立能生殖傳代的大鼠的胚胎干細胞株。本領域中，雖然已成功地從大鼠胚胎中提取干細胞，并通過抑制大鼠胚胎干細胞分化的特定基因通路，抑制大鼠胚胎干細胞分化，從而保持在原始胚胎階段。然而，在藥物及基因打靶后其大鼠干細胞的核型還是很不穩定，還得重新篩選才能得到穩定的用于注射的大鼠干細胞系。

因此，尚需一種新型的技術，能有效抑制大鼠胚胎干細胞分化，建立能生殖傳代的大鼠的胚胎干細胞株，并且使培養的大鼠干細胞可以經打靶后有穩定的核型。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于大鼠胚胎干細胞培養的培養基及相應的培養方法。

本發明的第一方面，提供一種用于大鼠胚胎干細胞的培養基，所述培養基包含基礎培養基和添加物，其中添加物包括分化抑制劑以及Pluripotin，并且所述的分化抑制劑包括GSK抑制劑、FGFR抑制劑和MAPK抑制劑。

在另一優選例中，所述的基礎培養基包括：DMEM培養基、DMEM/F12培養基、神經細胞基礎培養基或其組合。

在另一優選例中，所述的基礎培養基為DMEM/F12培養基與神經細胞基礎培養基按體積比0.5～1.5∶0.5～2混合配制而成。

在另一優選例中，所述的添加物還包括：

0.1～10mmol/L?β-巰基乙醇；

0.1～5mmol/L?L-谷氨酰胺。

在另一優選例中，所述的添加物還包括：Thiazovivin，濃度為0.1～10μmol/L，較佳的，濃度為0.5～5μmol/L，更佳地，濃度為0.8～2μmol/L。

在另一優選例中，所述培養基具有選自下組的1-4個特征：

(a)所述GSK抑制劑的濃度為0.5～20μmol/L；

(b)所述的FGFR抑制劑的濃度為0.2～10μmol/L；

(c)所述的MAPK抑制劑的濃度為0.2～10μmol/L；

(d)所述Pluripotin的濃度為0.1～10μmol/L；

其中，各濃度按大鼠胚胎干細胞的培養基的總體積計。

較佳地，按大鼠胚胎干細胞的培養基的總體積計，所述GSK抑制劑的濃度為1～10μmol/L；所述的FGFR抑制劑的濃度為0.5～5μmol/L；所述的MAPK抑制劑的濃度為0.5～5μmol/L；所述Pluripotin的濃度為0.5～5μmol/L。

更佳地，按大鼠胚胎干細胞的培養基的總體積計，所述GSK抑制劑的濃度為2～5μmol/L；所述的FGFR抑制劑的濃度為0.8～2μmol/L；所述的MAPK抑制劑的濃度為0.8～2μmol/L；所述Pluripotin的濃度為0.8～2μmol/L。

在另一優選例中，所述的分化抑制劑為CHIR99021和PD0325901。