[發明專利]一種轉基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110295141.7
• 申請日: 2011-09-28
• 公開（公告）號: CN102534046A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 岳靜;朱志成;邵雙
• 申請（專利權）人: 沈陽化工大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 沈陽技聯專利代理有限公司 21205
• 代理人: 張志剛

1.一種轉基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，該方法包括：利用Primer?Premier?V5.0軟件進行巢式PCR的引物設計，用Oligo?V6.22軟件篩選出相互干擾最小的引物；

擴增所用的引物及擴增片段大小為：

第一輪PCR所用引物

引物名稱：35S?EF?序列（5'→3'）ATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA

??????????35S?ER?序列（5'→3'）TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA

擴增片段大小：454bp；

第二輪PCR所用引物

引物名稱：35S?IF?序列（5'→3'）GCTCCTACAAATGCCATCATTGC

??????????35S?IR?序列（5'→3'）GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC

擴增片段大小：195bp；

第一輪PCR反應體系及反應程序為：在PCR反應體系中，加DNA模板2μL（50ng）；反應程序為94℃預變性10min、94℃變性40s、58℃退火40s、72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸5?min，4℃保存；

第二輪PCR反應體系及反應程序為：在第二輪PCR反應體系中，加第一輪PCR擴增產物2uL；反應程序為94℃預變性10min、94℃變性40s、56℃退火40s、72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸5?min，4℃保存待測；

兩輪PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并樣品分析，即可。

2.根據權利要求1所述的一種轉基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠濃度為2%，膠中溴化乙錠濃度為0.5μg/mL，電泳條件以10V/cm電壓，電泳時間1h。

3.根據權利要求1所述的一種轉基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，樣品分析為：第二輪PCR擴增片段大小與預期片段大小一致，表明樣品中檢測出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，即呈陽性；反之，則未檢出花椰菜花斑病毒CaMV35S啟動子，即呈陰性。

4.根據權利要求1所述的一種轉基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR檢測方法，其特征在于，第一輪PCR產物是否能觀察到與預期片段大小一致的DNA片段，均不作為判斷結果；而僅以第二輪PCR產物的觀察結果作為最后判斷結果。