[發明專利]微生物發酵合成阿卡波糖的方法

有效

• 申請號: 201110293699.1
• 申請日: 2011-09-29
• 公開（公告）號: CN102399837A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 鄭裕國;孫麗慧;李明剛;王遠山;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P19/00
• 分類號: C12P19/00;C12R1/045
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術領域

本發明屬于生物化工領域，涉及一種微生物發酵合成阿卡波糖的方法，特別涉及一種在發酵過程中通過添加腺苷蛋氨酸來提高阿卡波糖合成產量的方法。

(二)背景技術

阿卡波糖(Acarbose)是一種有效的α-糖苷酶抑制劑，它通過競爭性地抑制小腸壁上參與碳水化合物降解的α-葡萄糖苷酶的活性，延遲碳水化合物的分解消化，延緩和減少葡萄糖的吸收，從而達到控制人體內餐后的血糖水平，是臨床上用于治療II型糖尿病的口服藥物。

阿卡波糖分子式為C₂₅H₄₃NO₁₈，分子量645.6，pKa1值為5.1。上世紀70年代初Frommer等人于從放線菌Actinoplanes?utahensis的培養液中首先分離得到阿卡波糖，后經德國拜耳(Bayer)制藥公司研制開發，1990年阿卡波糖首先在德國上市，1996年獲得FDA批準在美國上市。

根據文獻和專利報道，目前國內外阿卡波糖的生產都是利用微生物發酵法制備而得到，其中游動放線菌應用的最為廣泛。為獲得高時空得率的產物，降低生產成本，以往大多數的研究多集中在高產菌株的誘變選育(包括采用物理、化學等常規方法進行誘變，也包括利用分子生物學技術改造菌種)、發酵培養基(包括碳源、氮源、金屬離子等)的優化、發酵條件(包括溫度、pH、溶氧、滲透壓、攪拌等條件)的優化以及對阿卡波糖生物合成途徑中相關基因簇的研究等方面。

對于發酵培養基的優化策略，目前主要是通過選擇合適的碳氮源，并控制發酵液中葡萄糖和麥芽糖的適當比例以及設計合理的補料策略來提高阿卡波糖的發酵單位。Lee等研究發現，添加麥芽糖比添加葡萄糖更有利于阿卡波糖的生產，示蹤研究結果表明，阿卡波糖的麥芽糖基團是直接從麥芽糖、麥芽三糖或較高分子的麥芽寡糖中得到；高敬紅等用Actinoplanes?sp?AC-17發酵生產阿卡波糖時研究發現，當葡萄糖和麥芽糖的質量比為2∶1時最有利于被菌體攝取用于阿卡波糖的生物合成。而對于發酵條件的優化策略，研究者發現，除了常規發酵參數，如溫度、pH、溶氧等條件會對發酵產量造成一定的影響，同時在微生物發酵中通常不考慮的一個參數-滲透壓，對阿卡波糖發酵的最終收率也具有明顯的影響作用，因而滲透壓參數在發酵過程中也常被控制在一個合理的范圍內。Beunink等研究發現，Actinoplanes?sp.SE50/110生產阿卡波糖時，培養液的滲透壓值在300～500mOsm/kg之間有助于阿卡波糖的生產，其最適宜的滲透壓值為400mOsm/kg；Choi和Shin的研究表明，Actinoplanes?sp.ATCC31044突變株CKD485-16最適宜的滲透壓值為500mOsm/kg，發酵水平達到3200mg/L，提高了39％。

阿卡波糖結構類似物是阿卡波糖發酵液中的常見雜質，阿卡波糖的結構(如式I所示)及其同系物的結構如表1所示。歐洲藥典對雜質組分的含量有嚴格的限制，特別是雜質組分C，其與阿卡波糖分子的結構差異僅在于末端糖苷鍵的不同，致使產品提取分離難度大，成本高。歐洲最新藥典要求雜質組分C的含量小于1.5％。因此，在生產過程中如何有效控制并降低雜質C的含量是工業化生產阿卡波糖的一個重要環節。

在現有的阿卡波糖生產工藝中，使用凝膠、大孔樹脂等可以去除雜質C或使其含量下降。但是，使用以上工藝在實際工業化生產中存在著上樣量小，收率低、成本高、質量低等諸多缺陷。

表1?阿卡波糖及其同系物結構

注：Ac＝Acarviose，Glc＝葡萄糖，Fru＝果糖，Man＝甘露糖

阿卡波糖是游動放線菌的次級代謝產物，而對于通過在培養液中外源添加小分子促進劑來提高阿卡波糖的發酵產量目前尚未有報道。腺苷蛋氨酸(SAM)(如式II所示)，是蛋氨酸的活性形式，它是一種存在于所有活體生物中的一種重要代謝中間體，是僅次于ATP的第二大廣泛使用的酶的底物，能夠參與生物體內多種生理過程，如轉甲基、轉硫、轉氨丙基等。SAM及其反應生成的中間物可進一步轉化，生成一些與信號傳導相關的分子(如AHL、AI-2)，這些信號分子能夠激活微生物代謝關鍵途徑相關基因的轉錄從而調節次級代謝產物的生產，所以SAM對于體內的代謝起著非常重要的調控作用。然而，關于SAM對微生物發酵阿卡波糖過程以及產量和質量的影響，目前還尚未有文獻報道。

(三)發明內容