[發明專利]可進行單分子核酸擴增的顆粒、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201110291304.4
• 申請日: 2011-09-29
• 公開（公告）號: CN102559864A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 陸祖宏;楊琦;葛芹玉;潘旻;涂景
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司 32112
• 代理人: 周靜

1.一種可進行單分子核酸擴增的顆粒，其特征在于，所述顆粒表面結合有多條單鏈核酸和一條雙鏈核酸，所述雙鏈核酸通過其中一條序列的一端與顆粒表面連接，并可作為雙鏈接頭與待測序核酸、以及末端雙鏈接頭順序連接，然后變性形成一條單鏈核酸分子模板，所述單鏈核酸分子模板可以以顆粒表面的單鏈核酸作為引物進行有效PCR擴增，在顆粒表面形成多條雙鏈測序模板，再將所述多條雙鏈測序模板轉化為多條單鏈測序模板后用于檢測待測序核酸的信息，所述顆粒單個體積在10^-5-10⁵立方微米之間。

2.如權利要求1所述的可進行單分子核酸擴增的顆粒，其特征在于，所述多條單鏈核酸為可對單條核酸分子模板進行橋式PCR擴增的多條上游引物和多條下游引物，所述上游引物或下游引物的序列中包含有酶切位點，所述雙鏈核酸可作為雙鏈接頭與待測序核酸、以及末端雙鏈接頭順序連接，然后變性形成連接在所述顆粒表面的單鏈核酸分子模板，所述單鏈核酸分子模板可以以顆粒表面的單鏈核酸作為引物進行有效PCR擴增，在顆粒表面形成多條雙鏈測序模板，通過酶切和變性將所述多條雙鏈測序模板轉化為多條單鏈測序模板后用于檢測待測序核酸的信息。

3.如權利要求2所述的可進行單分子核酸擴增的顆粒，其特征在于，所述下游引物的序列中包含有酶切位點。

4.如權利要求1所述的可進行單分子核酸擴增的顆粒，其特征在于，所述多條單鏈核酸為可對單條核酸分子模板進行PCR擴增的多條上游引物或多條下游引物，所述雙鏈核酸可作為雙鏈接頭與待測序核酸、以及末端雙鏈接頭順序連接，然后變性形成單鏈核酸分子模板，所述單鏈核酸分子模板可以以顆粒表面的單鏈核酸和游離的另一條單鏈核酸作為引物進行有效PCR擴增，在顆粒表面形成多條雙鏈測序模板，通過變性將所述多條雙鏈測序模板轉化為多條單鏈測序模板后用于檢測待測序核酸的信息。

5.如權利要求1-4中任一項所述的可進行單分子核酸擴增的顆粒，其特征在于，所述顆粒為表面包被有修飾基團的磁珠或PS微球，通過化學鍵與多條單鏈核酸和一條雙鏈核酸結合。

6.權利要求1-5中任一項所述可進行單分子核酸擴增的顆粒在測序文庫制備中的應用，其特征在于，將顆粒表面結合的雙鏈核酸作為雙鏈接頭與待測序核酸、以及末端雙鏈接頭順序連接，然后變性形成連接在所述顆粒表面的一條單鏈核酸分子模板，以顆粒表面的單鏈核酸作為引物對所述單鏈核酸分子模板進行有效PCR擴增，在顆粒表面形成多條雙鏈測序模板，再將所述多條雙鏈測序模板轉化為多條單鏈測序模板后用于檢測待測序核酸的信息。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述末端雙鏈接頭的一條序列的一端固定于固體基底表面，與待測序核酸連接后再與所述顆粒表面固定的雙鏈核酸連接，變性形成單鏈核酸分子模板，使連接有一條單鏈核酸分子模板的顆粒從固體表面釋放。

8.權利要求1-5中任一項所述可進行單分子核酸擴增的顆粒的制備方法，其特征在于，

(1)表面包被有修飾基團的顆粒與單鏈核酸混合，所述單鏈核酸的一端修飾有可與前述修飾基團反應的第一反應基團，修飾基團與第一反應基團反應，使單鏈核酸連接到所述顆粒表面；

(2)過量表面包被有修飾基團的顆粒與雙鏈核酸混合，所述雙鏈核酸的其中一條序列的一端修飾有可與前述修飾基團反應的第二反應基團，修飾基團與第二反應基團反應，使所述每顆顆粒表面至多連接一條雙鏈核酸；

上述步驟(1)和(2)的先后順序任意，最終得到表面結合有多條單鏈核酸和一條雙鏈核酸的顆粒，所述雙鏈核酸通過其中一條序列的一端與顆粒表面連接。