[發明專利]一種分離純化促性腺激素類糖蛋白亞基的方法

有效

• 申請號: 201110290791.2
• 申請日: 2011-09-29
• 公開（公告）號: CN103030691A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 金磊;郝鵬;馮秀萍;劉洪霞;張金亮;王英武
• 申請（專利權）人: 長春金賽藥業有限責任公司
• 主分類號: C07K14/59
• 分類號: C07K14/59;C07K1/22
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 王寶筠

發明領域

本發明是中國專利申請第201110269900.2號的繼續申請，屬于蛋白質純化領域，具體而言，本發明涉及分離并純化促性腺激素類糖蛋白亞基的方法。

背景技術

促性腺激素(gonadotropins)是一類調節脊椎動物性腺發育，促進性激素生成和分泌的糖蛋白激素，主要包括促卵泡激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)、絨毛膜促性腺激素(HCG)和促甲狀腺激素(TSH)。促黃體生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)由垂體前葉分泌，兩者協同作用，刺激卵巢或睪丸中生殖細胞的發育及性激素的生成和分泌；絨毛膜促性腺激素(HCG)由人胎盤分泌，可促進妊娠黃體分泌孕酮。懷孕初期尿中即可出現HCG，于妊娠兩個月時達高峰，臨床常以此作為妊娠指標。目前，重組人促卵泡激素也已由多家公司研制并上市用于治療不排卵者和輔助生殖技術超排卵者。

促性腺激素(LH，FSH，HCG和TSH)均由alpha(α)及beta(β)兩個亞基(肽鏈)通過非共價鍵組合而成，并含有糖基，糖基部分通過共價鍵結合于肽鏈上的天冬酰胺殘基、絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基上。人的LH、FSH、HCG與TSH的alpha-肽鏈結構相同，均由92個氨基酸組成，含10個半胱氨酸，連接成5個二硫鍵，并且含有2個N-糖基化位點，可以在重組生產過程中互相替代使用；而beta-肽鏈互不相同。另外，在藥物研發過程中，由于促性腺激素是一類結構非常復雜的糖蛋白，而且糖基對這些蛋白的生物學功能的性能及穩定性都起著決定性因素，因此如果要分離純化這些亞基，就不能破壞其糖基結構。

Amoresano等人描述了利用反相-高效液相層析(RP-HPLC)來分離并純化促性腺激素各亞基的方法[參見Amoresano，A.，Siciliano，R.，Orrù，S.，Napoleoni，R.，Altarocca，V.，De?Luca，E.，Sirna，A.，and?Pucci，P.(1996).Structural?characterization?of?human?recombinant?glycohormones?follitropin，lutropin?and?choriogonadotropin?expressed?in?Chinese?hamster?ovary?cells.Eur.J.Biochem.242，608-618.]。該方法用Vydac?C4柱(25*0.46cm，5μm)進行RP-HPLC進行純化，兩亞基上樣后在B相經25分鐘由洗脫液的變化梯度中被分別洗脫出來。然而，RP-HPLC通常用于小規模的分離鑒定，分離成本高，同時規模小，不適合產業化要求。而且，該方法使用的洗脫液包含對人體有害的三氟乙酸和乙腈，其中三氟乙酸具有強烈性刺激氣味、揮發性強，可吸入、口服或經皮膚吸收入人體，引起燒灼感、咳嗽、喘息、喉炎、氣短、頭痛、惡心、嘔吐、皮膚灼傷等，甚至引起肺水腫而致人死亡；而乙腈極易揮發，吸入體內后可引起乙腈中毒，造成人體衰弱、無力、面色灰白、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、胸悶、胸痛，嚴重的引起循環系統紊亂，呼吸淺、慢而不規則，血壓下降，脈搏細而慢，體溫下降，甚至陣發性抽搐，昏迷。

本發明人研發了不同于現有技術的促性腺激素亞基分離的方法，使用一個層析柱就完成分離促性腺激素中兩個亞基的過程，而且層析過程中不使用對人體有害和對環境有污染的試劑。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供不同于現有技術的促性腺激素兩個亞基的分離方法。其中，層析過程避免使用了對人體有害和對環境有污染的試劑，而且簡便、快速、成本低、產物純度高而降解小。

具體而言，本發明提供了分離并純化促性腺激素alpha亞基和beta亞基的方法，其包括：

(1)取含有促性腺激素的溶液與尿素混合，放置，然后稀釋；

(2)取步驟(1)得到的稀釋液直接上樣于用平衡緩沖液平衡的親和層析柱，收集流出液，然后加入平衡緩沖液，收集流出液，合并流出液中含促性腺激素alpha亞基的級分；

(3)然后，向親和層析柱加入洗脫緩沖液，收集洗脫液，合并洗脫液中含促性腺激素beta亞基的級分。

優選在本發明的方法中，促性腺激素是促卵泡激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)、絨毛膜促性腺激素(HCG)或促甲狀腺激素(TSH)，優選是FSH，更優選是重組人FSH(rhFSH)。在本發明的具體實施方式中，采用的是中國專利申請第201110269900.2號所述的rhFSH作為原料。