[發(fā)明專利]一對(duì)鵝源性成分PCR檢測(cè)用引物

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110290480.6
• 申請(qǐng)日: 2011-09-28
• 公開（公告）號(hào): CN102337337A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宗卉;汪燕玲;曹琛福;陶虹;劉建利;呂建強(qiáng);花群義;盧體康;秦智鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物物種和動(dòng)物源性成分鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)鵝源性成分的檢測(cè)方法，尤其涉及一對(duì)用于檢測(cè)鵝細(xì)胞線粒體核苷酸序列的引物。

背景技術(shù)

鑒別檢測(cè)畜、禽源性成分技術(shù)是肉食品和飼料出入境海關(guān)、貿(mào)易、檢驗(yàn)檢疫中關(guān)鍵定性技術(shù)，涉及到肉食品加工業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)、飼料業(yè)、檢驗(yàn)檢疫部門及其相關(guān)管理部門等領(lǐng)域。但是對(duì)于鵝的品種鑒定，以及產(chǎn)品中是否含有鵝源性成分還無快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法。

利用本發(fā)明引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增目的片段是線粒體DNA序列。線粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，是一個(gè)比較理想的用于物種鑒別檢測(cè)的靶基因序列，其主要原因是：(1)在所有組織細(xì)胞中均含有大量的線粒體，可以獲得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物種間具有高度的變異性；每個(gè)動(dòng)物細(xì)胞中存在許多拷貝的線粒體基因組，在采取相同體積的DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，線粒體基因組的模板數(shù)大大高于細(xì)胞核基因組的模板數(shù)，這就大大提高了PCR檢測(cè)的靈敏度。(2)mtDNA主要以編碼序列構(gòu)成，種內(nèi)的異質(zhì)基因很少。(3)不同種類的動(dòng)物線粒體基因組序列雖然高度同源，存在高度保守區(qū)域，但也存在一定的變異區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一對(duì)檢測(cè)鵝源性成分的引物。以解決準(zhǔn)確、快速、可靠的用PCR技術(shù)鑒定鵝源性成分。

本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

1.設(shè)計(jì)引物：用于檢測(cè)鵝源性成分的引物是根據(jù)線粒體DNA中高度保守的D-Loop區(qū)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體引物序列如下：

上游引物F：5’-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3’；

下游引物R：5’-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3’。

2.提取樣品DNA：采用氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒提取樣品DNA。

3.采用步驟1設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2.5μL?10×PCRBuffer(含Mg2+20mmol/L)，3μL?dNTPs(2.5mmol/L)，1μLTaq酶(2U/μL)，上下游引物F/R各3μL(終濃度為1.2μM)，DNA模板2μL，超純水補(bǔ)至25μL。可采用商業(yè)化的PCR反應(yīng)母液。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5min；然后94℃50sec，65℃40sec，72℃40sec循環(huán)35次；72℃3min。反應(yīng)完成后在4℃下保存。

4.電泳檢測(cè)：PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。若動(dòng)物產(chǎn)品和飼料中含有鵝源性成分，則在電泳圖304bp位置處出現(xiàn)擴(kuò)增目的條帶。

本發(fā)明的有益效果是，對(duì)活動(dòng)物、食用性動(dòng)物產(chǎn)品、非食用性動(dòng)物產(chǎn)品、動(dòng)物源性飼料及飼料添加劑等進(jìn)行品種鑒定。利用本發(fā)明的引物采用PCR方法可以有效檢出動(dòng)物產(chǎn)品和飼料中的鵝源性成分，并進(jìn)行鑒別檢測(cè)，其擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度為304bp，檢測(cè)最低限為0.01％。

附圖說明：

圖1鵝引物特異性PCR檢測(cè)電泳圖

圖中M.Marker?2000；1.鵝、2.火雞、3.鴨、4.鵪鶉、5.鴿、6.鴕鳥、7.雞、8.馬、9.牛、10.羊、11.豬、12.狗、13.驢、14.貓、15.魚；16.空白對(duì)照

圖2鵝引物靈敏度PCR檢測(cè)電泳圖

圖中M：marker?DL2000；1：100％(鵝DNA)；2：50％；3：10％；

4：5％；5：1％；6：0.1％；7：0.01％；8：空白

具體實(shí)施方式：

以下?lián)咀罴褜?shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

1.引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI中已經(jīng)發(fā)表的鵝線粒體基因組序列(登錄號(hào)為：EU571957)在D-Loop區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列如下：

上游引物F：5’-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3’；

下游引物R：5’-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3’。

2.樣品總DNA的提取

采用氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒，提取鵝、火雞、鴨、鵪鶉、鴕鳥、鴿、雞、馬、牛、羊、豬、驢、狗、貓、魚的基因組DNA，提取的基因組DNA均經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。測(cè)定OD₂₆₀/OD₂₈₀值均為1.8左右，說明DNA純度較高符合PCR擴(kuò)增要求。

3.鵝源性成分PCR擴(kuò)增

利用步驟1設(shè)計(jì)的特異性引物，以鵝DNA等為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。