[發(fā)明專利]家養(yǎng)鷓鴣(石雞)源性成分實時熒光PCR檢測引物與探針

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110290466.6
• 申請日: 2011-09-28
• 公開（公告）號: CN102337335A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宗卉;曹琛福;花群義;楊俊興;劉建利;廖立珊;盧體康;孫潔
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動物物種和動物源性成分鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測家養(yǎng)鷓鴣(石雞)源性成分的檢測方法，尤其涉及一對用于檢測家養(yǎng)鷓鴣(石雞)細胞線粒體核苷酸序列的引物探針。

背景技術(shù)

世界各國政府大多將食品安全、飼料安全視為涉及國家公共安全的問題，并紛紛加大監(jiān)管力度，特別是在出入境和市場的畜禽肉類食品、飼料及其商品的檢驗檢疫工作方面，加強了監(jiān)控畜禽肉類食品及其飼料的動物源性產(chǎn)品安全監(jiān)測技術(shù)研究，該檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用越來越受到重視。

實時熒光PCR擴增目的片段是線粒體DNA。線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質(zhì)，是一個比較理想的用于物種鑒別檢測的靶基因序列，其主要原因是：(1)在所有組織細胞中均含有大量的線粒體，可以獲得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物種間具有高度的變異性；每個動物細胞中存在許多拷貝的線粒體基因組，在采取相同體積的DNA樣品進行PCR檢測時，線粒體基因組的模板數(shù)大大高于細胞核基因組的模板數(shù)，這就大大提高了PCR檢測的靈敏度。(2)mtDNA主要以編碼序列構(gòu)成，種內(nèi)的異質(zhì)基因很少。(3)不同種類的動物線粒體基因組序列雖然高度同源，存在高度保守區(qū)域，但也存在一定的變異區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測家養(yǎng)鷓鴣(石雞)源性成分的引物和探針。以解決準(zhǔn)確、快速、可靠的用實時熒光PCR技術(shù)鑒定家養(yǎng)鷓鴣(石雞)源性成分。

本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

用于檢測家養(yǎng)鷓鴣(石雞)源性成分線粒體中COI的引物和探針序列包括：

上游引物F的序列為：5’-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3’；

下游引物R的序列為：5’-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3’；

探針序列P的序列為：5’(FAM)-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3’(ECLIPSE)。

本發(fā)明的原理為：在傳統(tǒng)的PCR擴增體系中加入一個與靶序列特異互補的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針，探針的5’端設(shè)計了一個報告熒光基因FAM，3’端設(shè)計了一個淬滅基因ECLIPSE。在探針完整的情況下，報告熒光基因發(fā)出熒光被淬滅基因吸收，此時檢測不到熒光信號。當(dāng)有特異PCR產(chǎn)物時，復(fù)性狀態(tài)下標(biāo)記探針與靶序列結(jié)合互補，形成局部雙鏈適合于5’-3’核酸外切活性的底物，激活Taq聚合酶的5’外切酶活性，將5’的熒光分子切除，報告熒光基因與淬滅基因分離，淬滅作用被解除，產(chǎn)生熒光信號，通過熒光定量PCR儀實時檢測熒光度，通過熒光度的變化來反應(yīng)是否擴增。

附圖說明：

圖1家養(yǎng)鷓鴣(石雞)引物和探針特異性熒光PCR圖

圖中A5：雞；B5：鴨；C5：鵝；D5：火雞；E5：鴿子；F5：鴕鳥；G5：鵪鶉；H5：牛；A6：山羊；B6：豬；C6：綿羊；D6：兔；E6：魚；F6：鹿；G6：狗；H6：驢；D8：馬E8：陰性對照；F8：石雞

圖2家養(yǎng)鷓鴣(石雞)引物和探針靈敏度熒光PCR檢測圖

圖中A：10^-1純石雞肉樣DNA；B：10^-2純石雞肉樣DNA；C：10^-3純石雞肉樣DNA；D：10^-4純石雞肉樣DNA；E：10^-5純石雞肉樣DNA；F：10^-6純石雞肉樣DNA；G：10^-7純石雞肉樣DNA；H：陰性對照

具體實施方式：

以下?lián)咀罴褜嵤├龑Ρ景l(fā)明作進一步詳述。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

1.引物和探針的設(shè)計：通過在動物分類學(xué)中相近的種如雞和鵪鶉線粒體基因序列比較分析，選擇高保守區(qū)段的COI基因設(shè)計并優(yōu)化引物和探針，序列如下：

上游引物F的序列為：5’-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3’；

下游引物R的序列為：5’-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3’；

探針序列P的序列為：5’(FAM)-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3’(ECLIPSE)。

2.樣品總DNA的提取