[發(fā)明專利]三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110290457.7
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102337271A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔朝霞;劉媛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A61P37/04;A23K1/17;A23L3/3544
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)

三疣梭子蟹(Portunus?trituberculatus)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類，由于其營養(yǎng)價值豐富、生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國重要海水養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大以及集約化程度不斷提高，由細(xì)菌、真菌等引起的多種疾病在三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體中頻頻爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

由于對三疣梭子蟹的免疫系統(tǒng)缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用傳統(tǒng)抗生素藥物防治，但長期盲目濫用藥物，造成抗藥性問題日益嚴(yán)重，非但難以有效地控制病情，反而帶來資金的浪費(fèi)，蟹品質(zhì)的下降，環(huán)境污染及對人類健康構(gòu)成潛在威脅等不良后果。因此，這就迫切需要從三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病機(jī)制和開發(fā)新型的抗菌藥物進(jìn)行免疫防治。

抗脂多糖因子(ALF)是一種能夠結(jié)合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，對正常真核細(xì)胞無毒害，日益受到廣泛關(guān)注。ALF最初是從美洲鱟中發(fā)現(xiàn)，它可以結(jié)合LPS，并對R型革蘭氏陰性菌有明顯的抑制生長作用。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，鱟ALF結(jié)構(gòu)中有兩個高度保守的半胱氨酸殘基，它們形成二硫鍵所限制的β折疊區(qū)域即為LPS結(jié)合域。體外合成鱟ALF的LPS結(jié)合域，證明其確實(shí)可以與LPS結(jié)合，能夠在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，有助于保護(hù)小鼠免受內(nèi)毒素的攻擊。隨后，從對蝦、螯蝦、蟹等甲殼動物中也鑒定或克隆出多種抗脂多糖因子。研究表明這些甲殼動物ALF的表達(dá)水平在細(xì)菌刺激后明顯上調(diào)，其重組蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長，提示ALF在甲殼動物固有免疫中發(fā)揮重要作用。

到目前為止，關(guān)于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的報道較少。因此，識別、定性抗菌效應(yīng)分子-抗脂多糖因子對研究三疣梭子蟹的免疫防御機(jī)制和進(jìn)行病害防治具有重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因為序列表SEQ?ID?No.1中的堿基序列所示。

三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白：所述PtALF-2基因編碼蛋白為序列表SEQ?ID?No.2中氨基酸序列所示。

三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白的應(yīng)用：所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。

所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、愛德華氏菌，革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(EST)、RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中克隆到PtALF-2基因cDNA全長序列，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼PtALF-2成熟肽的基因片段并將其克隆到pET32a(+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)-plysS實(shí)現(xiàn)體外重組表達(dá)。重組蛋白經(jīng)TALON柱純化和透析復(fù)性后，對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為1.02μM、2.04μM、4.07μM、16.30μM、65.19μM；而對真菌畢赤酵母沒有明顯的抑制作用。

本發(fā)明基因及其重組蛋白在藥物生產(chǎn)、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產(chǎn)中的應(yīng)用，另外還可以進(jìn)一步研究三疣梭子蟹免疫防御機(jī)制提供基礎(chǔ)，并為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)例提供的純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2編碼成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物(其中，M：DNA?marker，1：成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物)。

圖2為本發(fā)明實(shí)例提供的誘導(dǎo)和純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2重組蛋白(其中M：蛋白marker；1：未誘導(dǎo)菌體中表達(dá)的蛋白；2：IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白；3：純化的重組蛋白)。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。