[發(fā)明專利]一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A1聚集體的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110290426.1
• 申請日: 2011-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN102337256A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于殿宇;胡立志;王立琦;杜晶;王妍;李越;張佳寧;時(shí)敏;陳曉慧;李志平;王雪;宋云花;周旋;奚會(huì)松
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/10
• 分類號(hào): C12N11/10;C12N11/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于用包埋-交聯(lián)酶聚集體來固定磷脂酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、磷脂酶A₁的固定化：1、磷脂酶A₁聚集體的制備：將1mL酶加入到一定量的pH值為5.0的磷酸二氫鈉與檸檬酸緩沖液中，在0℃下緩慢加入無水乙醇并持續(xù)攪拌，從而保證酶聚集體顆粒均勻。冰浴反應(yīng)一段時(shí)間，然后于10000rpm離心，收集沉淀。2、交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的制備及包埋過程：向聚集體懸浮液中加入一定濃度的戊二醛，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，離心去除上清液，用緩沖液沖洗交聯(lián)酶聚集體數(shù)次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮。在一定濃度的20mL海藻酸鈉溶液中加入上述酶聚集體1mL，攪拌均勻。靜止一段時(shí)間后，用滅菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度CaCl₂溶液中制成微膠囊，將形成的微膠囊在4℃的CaCl₂溶液中放置一段時(shí)間使其進(jìn)一步硬化。然后抽濾得到硬化的微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3～5次，以洗去表面的CaCl₂，然后進(jìn)行冷凍干燥備用。二、酶活力的測定：一定量的底物無油磷脂溶于預(yù)定pH值的緩沖液中，經(jīng)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆颉Ｈ?個(gè)100mL三角瓶，2個(gè)作為空白瓶，2個(gè)作為樣品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于預(yù)定溫度的水浴中預(yù)熱5min，然后在各瓶中加入一定質(zhì)量的經(jīng)復(fù)水后的固定化酶，立即混勻計(jì)時(shí)，在預(yù)定溫度的水浴中180r/min的條件振蕩準(zhǔn)確反應(yīng)15min，然后于樣品瓶中立即補(bǔ)加95％乙醇15mL終止反應(yīng)，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)堿液平均消耗量。三、固定化條件的優(yōu)化：分別在酶液濃度0.02～0.07g/mL、沉淀劑飽和度65～90％、沉淀pH3～8、沉淀時(shí)間15～65min、交聯(lián)劑濃度0.1～0.6％、交聯(lián)時(shí)間3.5～8.5h、海藻酸鈉濃度0.5～3％、鈣離子濃度0.1～0.35mol/L的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。四、固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的討論：在溫度40～70℃，PH?4.5～7范圍內(nèi)，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適pH值。并通過重復(fù)測定酶活來討論固定化酶的使用穩(wěn)定性。五、通過固定化酶膜的SEM圖像進(jìn)一步解釋包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的優(yōu)勢。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將酶液濃度0.03～0.07g/mL的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀劑飽和度70～85％的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀pH4～7的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀時(shí)間25～55min的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將交聯(lián)劑濃度0.2～0.5％的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將交聯(lián)時(shí)間4.5～7.5h的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將海藻酸鈉濃度1～2.5％的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包埋-交聯(lián)磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將鈣離子濃度0.15～0.3mol/L的條件下進(jìn)行磷脂酶A₁的固定。