[發明專利]一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法

無效

• 申請號: 201110290426.1
• 申請日: 2011-09-20
• 公開（公告）號: CN102337256A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 于殿宇;胡立志;王立琦;杜晶;王妍;李越;張佳寧;時敏;陳曉慧;李志平;王雪;宋云花;周旋;奚會松
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04
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• 代理人: 暫無信息

1.一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于用包埋-交聯酶聚集體來固定磷脂酶的方法通過以下步驟實現：一、磷脂酶A₁的固定化：1、磷脂酶A₁聚集體的制備：將1mL酶加入到一定量的pH值為5.0的磷酸二氫鈉與檸檬酸緩沖液中，在0℃下緩慢加入無水乙醇并持續攪拌，從而保證酶聚集體顆粒均勻。冰浴反應一段時間，然后于10000rpm離心，收集沉淀。2、交聯磷脂酶A₁聚集體的制備及包埋過程：向聚集體懸浮液中加入一定濃度的戊二醛，攪拌反應一段時間，離心去除上清液，用緩沖液沖洗交聯酶聚集體數次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮。在一定濃度的20mL海藻酸鈉溶液中加入上述酶聚集體1mL，攪拌均勻。靜止一段時間后，用滅菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度CaCl₂溶液中制成微膠囊，將形成的微膠囊在4℃的CaCl₂溶液中放置一段時間使其進一步硬化。然后抽濾得到硬化的微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3～5次，以洗去表面的CaCl₂，然后進行冷凍干燥備用。二、酶活力的測定：一定量的底物無油磷脂溶于預定pH值的緩沖液中，經磁力攪拌器充分攪拌，混合均勻。取4個100mL三角瓶，2個作為空白瓶，2個作為樣品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于預定溫度的水浴中預熱5min，然后在各瓶中加入一定質量的經復水后的固定化酶，立即混勻計時，在預定溫度的水浴中180r/min的條件振蕩準確反應15min，然后于樣品瓶中立即補加95％乙醇15mL終止反應，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH標準溶液滴定，計算標準堿液平均消耗量。三、固定化條件的優化：分別在酶液濃度0.02～0.07g/mL、沉淀劑飽和度65～90％、沉淀pH3～8、沉淀時間15～65min、交聯劑濃度0.1～0.6％、交聯時間3.5～8.5h、海藻酸鈉濃度0.5～3％、鈣離子濃度0.1～0.35mol/L的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。四、固定化酶酶學性質的討論：在溫度40～70℃，PH?4.5～7范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適pH值。并通過重復測定酶活來討論固定化酶的使用穩定性。五、通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的優勢。

2.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將酶液濃度0.03～0.07g/mL的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

3.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀劑飽和度70～85％的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

4.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀pH4～7的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

5.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀時間25～55min的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

6.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將交聯劑濃度0.2～0.5％的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

7.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將交聯時間4.5～7.5h的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

8.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將海藻酸鈉濃度1～2.5％的條件下進行磷脂酶A₁的固定。

9.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法，其特征在于步驟三中將鈣離子濃度0.15～0.3mol/L的條件下進行磷脂酶A₁的固定。