[發明專利]一種快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的方法

有效

• 申請號: 201110289811.4
• 申請日: 2011-09-28
• 公開（公告）號: CN102367468A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 饒志明;許正宏;楊娟;徐美娟;竇文芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基于L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的方法，屬于工業微生物育種技術領域。

背景技術

L-精氨酸是人體和動物體內的半必需堿性氨基酸，是合成蛋白質肌酸的重要原料，也是生物體尿素循環的一種重要中間代謝產物，因此在醫藥和食品工業中具有廣泛用途。

發酵法生產L-精氨酸是目前商業化生產比較有效和經濟的方法，而優良的L-精氨酸高產菌株是發酵生產L-精氨酸的關鍵。目前L-精氨酸高產菌株的選育主要是通過傳統的誘變育種和現代基因工程育種獲得，其中基因工程育種因其目的性強，工作量小而倍受研究者們青睞，而誘變育種獲得的菌種生產性能往往較穩定，因此仍在生產實踐中廣泛運用。生產實踐中還發現，產L-精氨酸菌種在保存傳代過程中，生產性能會逐漸衰退，產酸和轉化率會不斷下降，因此必須定期進行復壯，即從衰退的菌株中，通過分離、純化篩選出未衰退的菌株，這樣才能保持菌株的高產性能，不斷滿足生產需要。無論是用傳統誘變、用現代基因工程手段對現有L-精氨酸高產菌株的改造，還是高產菌株的復壯，都需要從眾多的單菌株中挑選出高產菌株。所以，高產L-精氨酸菌株的選育工作在L-精氨酸的發酵生產中必不可少。傳統的L-精氨酸高產菌株的篩選主要是通過篩選抗L-精氨酸結構類似物菌株，抗結構類似物抗性強的菌株其產量相應就會較高。但是，由于L-精氨酸的結構類似物種類較多且價格昂貴，因此使得篩選工作強度大、效率低且成本較高。

本發明從另一角度出發，建立了一種快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的平板顯色法。微生物中從L-谷氨酸合成L-精氨酸有3條途徑：線性途徑、循環途徑及新發現的利用氨甲酰基轉移酶進行L-精氨酸生物合成的新途徑，大腸桿菌及古細菌主要以線性途徑合成L-精氨酸，而釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌、假單胞菌等微生物則以循環途徑合成L-精氨酸，圖1。大腸桿菌中，L-精氨酸合成途徑中的N-乙酰谷氨酸激酶argB恰好位于精氨酸琥珀酸酶argH的上游，本發明通過敲除argH基因獲得L-精氨酸缺陷型大腸桿菌，以E.coli?BL21基因組DNA為模板PCR獲得argBH基因片段，在argH內部插入卡那霉素抗性基因(Kan)，實現對argH的敲除從而獲得該酶缺失的L-精氨酸缺陷型大腸桿菌。將L-精氨酸缺陷型菌株作為L-精氨酸分泌的指示菌通過交互共養法以TTC為顯色劑實現鈍齒棒桿菌胞外精氨酸濃度高低的定性篩選，在平板上初篩出合成L-精氨酸能力高或分泌性能較優型菌株，進而再通過搖瓶發酵復篩，該方法大大提高了菌種選育中的篩選效率而且節約了成本。因此，本發明對篩選高產L-精氨酸菌株有著積極的作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于大腸桿菌L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的方法。

本發明的技術方案：首先構建大腸桿菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株，應用該菌株平板顯色法篩選L-精氨酸高產菌株。

大腸桿菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株構建方法如下：

(1)argBH的擴增：以E.coli?BL21基因組DNA為模板，用引物P15’-CGCGAATTCATGAATCCATTAATTATCAAACTGG-3’(EcoR?I)、P25’CGCGTCGACTTACCCTAACCGAGC?CTGC-3’(Sal?I)擴增argBH基因，擴增循環條件：94℃預變性5min，94℃變性40s，56℃退火90s，72℃延伸90s，35個循環。

(2)質粒pMD-18T-argBH::Kan的構建：PCR獲得的argBH基因片段電泳膠回收后與pMD-18T載體16℃過夜連接，轉化E.coli?JM109，挑取陽性轉化子并驗證獲得E.coli?JM109(pMD-18T-argBH)。將T-Kan用EcoRV酶切后膠回收其中大小約為1.4kb的包含Kan抗性基因的片段，并將其與同樣用EcoRV酶切后的T-argBH進行連接(EcoRV位點位于argH內部)，轉化E.coli?JM109，挑取陽性轉化子并驗證獲得E.coli?JM109(T-argBH::Kan)。