[發明專利]一種高產γ-氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201110289796.3
• 申請日: 2011-09-28
• 公開（公告）號: CN102367432A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 饒志明;田靈芝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/63;C12P13/00;C12R1/19
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技術領域

一種高產γ-氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構建方法及其應用，屬于發酵工程中生物技術領域。具體涉及一種構建遺傳工程菌的方法、重組酶酶學性質研究及其在轉化L-谷氨酸產γ-氨基丁酸上的應用。

背景技術

γ-氨基丁酸(簡稱GABA)是一種在中樞神經系統中有效的抑制性神經遞質，具有許多重要的生理功能，如降血壓、保持神經安定、增強記憶、調節激素分泌、促進生殖、保肝利腎等。近年來，GABA的研究和應用受到了廣泛的關注。目前，國內外主要采用化學合成法和微生物法制備GABA，化學合成法反應條件劇烈，污染嚴重；微生物發酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過程復雜且生產周期長；全細胞轉化法合成GABA則可提高底物轉化率和產品純度，且具有節約后處理工序、縮短生產周期及降低環境污染等優點，越來越受到國內外研究者的廣泛重視。

本發明課題組專利“一株高效轉化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸乳酸菌的選育”公開號：101928679A公開日：2010.12.29，該專利公開了以植物乳桿菌(LP-GB?01-21)為生產菌株，5L發酵罐水平，在pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液中進行全細胞轉化，最終GABA濃度達到132g/L，摩爾轉化率為94.3％，產量明顯高于其他同類菌株，但由于植物乳桿菌是兼性厭氧微生物，培養條件較難控制，GABA的生產效率受培養條件影響較為顯著；同時，植物乳桿菌中GAD的表達量受菌體代謝狀態的控制，表達量有限，全細胞轉化效率仍有待于提高。鑒于此，本研究擬通過構建GAD高表達型重組大腸桿菌，借助大腸桿菌生長迅速、易于高密度培養和GAD表達可以人工調控的優點進行GABA大規模和高效率生產。另外，GAD是生物催化L-谷氨酸脫羧反應生成γ-氨基丁酸的限速酶，通過對該酶的酶學性質進行研究，即酶的熱穩定性、pH穩定性及溫度、pH與酶活性的關系，幾種金屬離子對酶的影響，來確定該酶作用的合適條件指導全細胞轉化法合成GABA，并為工業化制備GABA提供了參考依據。

發明內容

本發明的目的在于提供：一種高產GABA重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構建方法，并對重組谷氨酸脫羧酶(GAD)酶學性質進行研究，根據酶學性質的研究結果確定了最優轉化條件，為微生物轉化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸的工業化提供了有益的指導。

本發明的技術方案：提取總Lactobacillus?plantarum染色體為模板，根據GeneBank公布的植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因組序列設計引物如下：

P1：5’-GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3’；(下劃線為BamH?I酶切位點)

P2：5’GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT?TAAAGCTGTT-3’(下劃線為Not?I酶切位點)進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94℃，5min預變性；94℃50s，57℃1min?30s，72℃2min，35個循環；72℃延伸10min。所得片段經膠回收后與克隆載體pMDl8-T連接，轉化E.coli?JMl09，經過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉化子。提取質粒酶切鑒定，將重組質粒命名為T-Lpgad，采用相同限制性內切酶分別對T-lpgad和pET-28a(+)進行雙酶切，膠回收lpgad片段，將其與線性化載體pET-28a(+)混合，在T4連接酶的作用下過夜連接，再轉化大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)感受態細胞，卡那霉素抗性篩選陽性菌落，提取質粒，進行雙酶切驗證，將符合預期結果的陽性轉化子于-80℃冰箱中保藏。

取凍管保藏的菌種接種至含卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日轉接LB培養基中，IPTG誘導表達，粗酶液采用比色法進行酶活測定，一個酶活力單位(U)定義為在測定條件下每分鐘產生1μmol?GABA所需的酶量，粗酶液蛋白質含量采用Bradford法測定，以BSA為標準蛋白。粗酶液經Ni-NTA純化得到重組GAD，并對其酶學性質進行初步研究。

通過對重組谷氨酸脫羧酶GAD酶學性質的初步研究，確定了其最適作用溫度、最適pH以及具有較強促進作用的金屬離子種類及濃度，根據酶學性質的研究結果，對全細胞轉化條件進行優化，5L發酵罐水平，對重組菌進行轉化產GABA實驗。