[發明專利]制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法

有效

• 申請號: 201110289412.8
• 申請日: 2011-09-24
• 公開（公告）號: CN102321727A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 閆治斌;雷玉明
• 申請（專利權）人: 甘肅省敦煌種業股份有限公司玉門市種子公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

1.制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟：

(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷：分別在制種玉米田苗期——拔節期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現和病征表現，判定——

當玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內側有黑色粉末，且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時，即判定為果穗發霉；

當脫去玉米籽粒的穗軸發軟，剖開所述穗軸后其內側表面出現黑色霉狀物，顯微鏡檢測為病菌菌絲體和分生孢子時，即判定為穗軸發霉；

當玉米果穗上形成籽料為20～80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無光澤；或籽粒為糠粒，果穗開裂時，即判定為籽料秕瘦；

當玉米果穗開裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質，顯微鏡檢測為黑色分生孢子時，即判定為籽料粉化；

當玉米葉片正反面可見黑色煤污狀的斑點，隨斑點擴大，病斑邊緣出現黃色暈圈時，即判定為葉片污斑；

(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定：

保濕誘發分離：將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30～50mm的小段，用清水沖冼干凈，置于鋪有2～3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養皿內，蓋上皿蓋，在20～25℃保溫保濕培養24h，觀察有無菌體生長：

若有菌絲出現，繼續培養2～3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔：當分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4.1～7.9μm，頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為13.4～17.8μm時，即判定為稻黑孢菌；

若無菌體生長，則采用下述方法進行判定：

a、組織分離：將新發病株或新收玉米種子在無菌條件下，先用體積濃度為75％的酒精溶液消毒60min±2min，然后在質量濃度為0.1％的升汞溶液中消毒20～30s，其次用無菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，每皿10粒，25℃±2℃光照培養箱中培養5～7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落；其中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基是指每1000ml培養基含200g馬鈴薯、20g瓊脂、20g葡萄糖的培養基；

b、病原菌的純化：挑取所述步驟a所得的單個菌落，轉接于瓊脂平板上培養，待長出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個分生孢子于斜面所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，獲得單孢培養物；

c、致病性測定：將所述步驟b所得的單孢培養物用無菌水清洗后，用無菌水配制成濃度為1.5×10⁶～2.0×10⁶個分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中，在壓力為1.5磅±0.01磅、溫度為120～121℃條件下滅菌30min±2min，制成無菌麥粒；在無菌條件下，將孢子懸浮液接種于無菌麥粒上，放入25℃±2℃恒溫培養箱中培養7～10d后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項穴接所述麥粒接菌體4g；同時，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對照，分不同生育期測定發病癥狀，若發病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌；

d、病原菌種類的鑒定：依據培養性狀和顯微鏡檢測、致病性測定結果，即判定為稻黑孢菌。

2.如權利要求1所述的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，其特征在于：所述步驟(2)c中的無菌水是指蒸餾水在壓力為1.5磅、溫度為120℃條件下滅菌30分鐘的水。