[發明專利]煙酰胺腺嘌呤二核苷酸基因編碼熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110288807.6
• 申請日: 2011-09-26
• 公開（公告）號: CN102344494A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 楊弋;金晶;趙玉政;呼慶勛
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N21/64;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;A61K49/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊帆

1.一種遺傳編碼的NADH熒光探針，其內含有對環境內NADH敏感的多肽，和通過光譜性質的改變對環境內NADH進行表現的部分。

2.如權利要求1所述的NADH熒光探針，其特征在于，所述通過光譜性質的改變對環境內NADH進行表現的部分是熒光蛋白序列或其衍生物。

3.如權利要求1所述的NADH熒光探針，其特征在于，所述對NADH敏感的多肽是具有如下特征的多肽，或其功能片段或NADH結合結構域：

(1)具有NADH結合特性的Rossman結構域；和/或

(2)來源于對NADH敏感的轉錄調控因子Rex家族蛋白。

4.如權利要求1或3所述的NADH熒光探針，其特征在于，所述對NADH敏感的多肽包含：

(1)來自于細菌的轉錄調控因子Rex蛋白基因ydiH的多肽，該多肽可以由SEQ?ID?NO：1、2或3編碼；

(2)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有95％相同性的同源或非同源序列；

(3)在85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有90％相同性的同源或非同源序列；

(4)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有70％相同性的同源或非同源序列；

(5)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有50％相同性的同源或非同源序列；

(6)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有40％相似性的同源或非同源序列；或

(7)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有35％相似性的同源或非同源序列。

5.如權利要求1-4中任一項所述的NADH熒光探針，其特征在于，所述熒光探針可以包含具有NADH結合特性的Rossman結構域B和熒光蛋白序列A、A1和/或A2，其組合形式可以是：

(1)B-A-B；

(2)B-A-B-B；

(3)A1-B-A2，其中A1和A2可以相同或不同；A1可以是來自于維多利亞多管發光水母的熒光蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2可以是來自于維多利亞多管發光水母的另一熒光蛋白或其衍生物的氨基酸序列；

(4)B的第一部分-A-B的第二部分；其中A插入在B的柔性區域內，因而將B分割成B的第一部分和B的第二部分，B的第一部分和B的第二部分構成完整的B結構域；或

(5)B的第一部分-A-B的第二部分-B；其中A插入在B的柔性區域內，因而將B分割成B的第一部分和B的第二部分，B的第一部分和B的第二部分構成完整的B結構域。

6.如權利要求5所述的NADH熒光探針，其特征在于，所述熒光探針包含：

(1)氨基酸序列SEQ?ID?NO：4、5、6、7或8；

(2)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有95％相同性的同源或非同源序列；

(3)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有90％相同性的同源或非同源序列；

(4)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有70％相同性的同源或非同源序列；

(5)在至少85個氨基酸殘基內任何與(1)所述序列具有50％相同性的同源或非同源序列；

(6)在至少85個氨基酸殘基內與(1)或(2)或(3)所述序列實質上相似或相同的氨基酸序列；或

(7)(1)或(2)或(3)或(4)所述序列的變異體或衍生物。

7.一種融合蛋白，其包含權利要求1所述的熒光探針。

8.如權利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由權利要求1所述熒光探針與各種特異性亞細胞定位信號融合形成的，所述定位信號可將目標蛋白定位于指定的亞細胞器內。

9.一種核酸序列，其包含編碼權利要求1-6中任一項所述熒光探針的核苷酸序列。

10.一種核酸序列，其包含編碼權利要求7-8中任一項所述融合蛋白的核苷酸序列。

11.一種編碼NADH熒光探針的核酸序列，其中含有編碼熒光蛋白的核苷酸序列和編碼對NADH敏感的蛋白質的核苷酸序列。