[發明專利]一種用兔源細胞生產豬瘟活疫苗的方法

無效

• 申請號: 201110288660.0
• 申請日: 2011-09-27
• 公開（公告）號: CN102327610A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 柯浩;吳旋
• 申請（專利權）人: 南京創啟生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/187
• 分類號: A61K39/187;C12N7/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域，尤其是涉及一種用兔源細胞生產豬瘟活疫苗的方法。

背景技術

豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus，CSFV)是一種危害嚴重的動物病毒，它引起的豬瘟每年給養豬業造成巨大的經濟損失。目前世界上主要采用弱毒活疫苗免疫來防治豬瘟，以控制豬瘟的流行。在異源原代細胞中增殖的豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是目前我國主要的弱毒疫苗。C株是我國五十年代經兔體傳代選育出的一株具有良好免疫保護力的疫苗株。由于該疫苗株性能穩定、安全、保護性好，是國際上公認最好也是應用最為廣泛的疫苗株。由于應用的需要，我國豬瘟病毒的疫苗生產也由兔脾淋疫苗、全乳兔疫苗逐步過渡到用組織培養生產的細胞疫苗。為避免豬體可能帶有的病原體(包括病毒)對疫苗質量的影響，目前生產上使用牛睪丸或羊腎細胞增殖豬瘟兔化弱毒疫苗。

由于我國牛群中病毒性腹瀉病毒(BVDV)的感染率很高，幾乎是100％，因此用牛睪丸細胞生產豬瘟疫苗，易造成細胞外源病毒污染，且病毒滴度不高，生產工藝不穩定，疫苗批次之間的差異大，嚴重影響了疫苗的質量；同樣，使用羊腎細胞生產豬瘟疫苗，由于羊群中可能存在邊界病毒(BDV)，也存在同樣的隱患。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、羊邊界病毒(BDV)與豬瘟病毒(HCV)同屬于黃病毒科瘟病毒屬，三種病毒之間有較密切的抗原性與血清學關系，能互相誘導一定程度的同源病毒抗體，使用污染了BVDV或BDV的豬瘟細胞疫苗給豬只免疫接種后，BVDV或BDV會對豬瘟疫苗的免疫產生干擾作用，能抑制豬瘟抗體的產生，引起嚴重的后果。

國內一些研究單位和動物疫苗生產廠家嘗試使用細胞系生產豬瘟疫苗，從一定程序上可以避免外源病毒污染，提高免疫效果，但是傳代細胞存在致瘤的可能性，用于豬瘟疫苗的生產有潛在的食品安全上的危險。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術存在的不足之處，提供一種用兔源細胞生產豬瘟活疫苗的方法。該方法生產工藝簡單、易操作，病毒含量高，批間差異小，質量易控，可顯著提高疫苗質量。利用本發明生產的豬瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，對豬瘟強毒攻擊能產生完全的免疫保護作用。

本發明的用兔源細胞生產豬瘟活疫苗的方法，其步驟包括：制苗用細胞的選擇、制苗用細胞的制備、細胞毒種的繁殖、制苗毒液的繁殖、配苗，分裝及凍干，其具體步驟如下：

1、制苗用細胞的選擇：為健康乳兔或成年兔的腎臟或睪丸；

2、制苗用細胞的制備：

(1)兔腎(或兔睪丸)的采集和處理：先以常水泡濕兔毛，取出后瀝干，再放入1％新潔爾滅液中浸泡30秒鐘，經體表消毒后，移入無菌室，以無菌手術采取兔腎(或兔睪丸)，迅速放入含400IU/ml青霉素和400μg/ml鏈霉素的漢克氏液中，浸泡30分鐘，再用無菌操作除去被膜、腎盂、腎盞、附睪，組織稱重后，將其剪成1～2mm小塊，用漢克氏液反復沖洗，至上清液清亮為止；

(2)消化：將組織塊移入消化瓶中，兔腎加入5～6倍(兔睪丸加入6～8倍)組織質量體積比的0.25％胰酶溶液，塞緊瓶口，置37℃水浴消化60分鐘。消化過程中，每隔10分鐘輕搖消化瓶一次，直到組織塊周圍出現棉絮狀時，輕取消化瓶，棄上清，再沿瓶壁緩緩注入漢克氏液(含200IU/ml青霉素和200μg/ml鏈霉素)，輕洗2次，以除去殘存胰酶；

(3)細胞分散：加入生長液，以玻璃珠振搖法分散細胞。輕搖消化瓶十五次，靜止，待組織沉淀后，將上清細胞懸液經過管道流入已加生長液的內裝有四層紗布袋的收集瓶中。如此反復分散3～4次。

(4)細胞分裝和培養：將收集瓶中的細胞懸液充分搖勻后，分裝于培養瓶中，補加生長液至瓶容積的1/10，塞緊瓶口，繼續培養，形成良好單層時，用于接種病毒(兔腎細胞)或繼續傳代(兔睪丸細胞)。

(5)細胞傳代：兔睪丸原代細胞長成單層后，用EDTA-胰酶細胞分散液消化，以(1∶3)～(1∶5)制成次代細胞懸液，以細胞生長液繼續培養，形成良好單層時，用于接種病毒。

(6)細胞檢驗：細胞用于接毒前，按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄40～44、49頁進行檢驗，應無細菌、霉菌、支原體、外源病毒生長。

3、細胞毒種的繁殖：用細胞維持液，將新鮮脾毒制成病毒懸液接種生長良好的上述細胞單層，繼續培養；每隔4～5日收獲換液一次，取二收、三收細胞培養毒液作為生產用毒種；