[發明專利]牛體細胞病毒誘導方法

無效

• 申請號: 201110286503.6
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102358891A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 曹鴻國;章孝榮;楊盼;蒲勇;張運海;劉亞;陶勇;方富貴;李運生;任春環;張子軍;劉洪瑜;丁建平
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

[技術領域]

本發明涉及細胞誘變技術領域，尤其涉及一種牛體細胞病毒誘導方法。

[背景技術]

在自然界中物競天擇適者生存是自然選擇的結果，生命機體在自然界生存 過程中不斷地調整自己以便更好地適應自然環境。誘變在新品種培育的過程中 發揮著重要的作用，在當今的世界廣大科技工作者積極投身到動植物的新品種 培育，以期獲得優質、高產、生產性能強的動植物品種。為了得到優秀的動植 物新品種個體國家開展了太空育種，將動植物的種子或個體帶到太空，這些材 料在太空高強度紫外線、電離輻射等的情況下遺傳生物信息發生改變，即突變， 有利的遺傳信息的突變會產生優質、高產、生產性能強的動植物新品種，從而 服務于人類的生產和生活。發生誘變的生物材料由于正常細胞的DNA或基因發 生突變，遺傳性狀發生變化，并具有穩定的表型變化，變異性狀能夠穩定的遺 傳給后代。一般情況下，引發生物材料發生誘變的因素稱為誘變劑，常見的有 高溫、電離輻射、化學藥物等。慢病毒載體作為一類重組逆轉錄病毒載體在轉 基因生產中具有方便、快捷、高效和穩定轉染等優點，目前已成為一種重要的 基因轉移工具被廣泛應用于基因導入細胞分子生物學研究領域。慢病毒是逆轉 錄病毒家族的成員，病毒能夠利用自身組分將外源基因整合入宿主細胞基因組 中，從而使外源基因隨著宿主細胞的分裂增殖和傳代而穩定表達。在試驗中發 現慢病毒多次感染牛胎兒成纖維細胞后能夠引起細胞發生誘變，誘變的細胞在 形態和生長性能等方面呈現特征性變化，表現出一定干細胞特征，為探討細胞 在生長、發育和重構等方面提供理想的材料和手段。

[發明內容]

本發明要解決的技術問題是提供一種牛體細胞病毒誘導方法。使用該方法 可以簡單、高效、快速地引起牛體細胞發生誘變。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，牛體細胞病毒誘導方 法，包括如下步驟：

1)取懷孕2.5月齡牛的胎兒，采用組織塊培養法建立牛的胎兒成纖維細 胞系；

2)磷酸鈣介導pLentilox3.7慢病毒表達載體及其包裝組分在293T細 胞中包裝形成慢病毒顆粒，12-16h后更換新鮮高糖DMEM培養液，病 毒包裝48h后收集含慢病毒的高糖DMEM培養液，經超濾濃縮后添加 到牛胎兒成纖維細胞培養板內；

3)每天病毒感染一次，共計使用病毒液感染細胞4次，病毒感染2次后 更換含1000U/ml?LIF、4ng/ml?bFGF的高糖DMEM培養液；

4)當細胞形態出現集落變化后，將細胞集落經Di?s?pa?se消化后接種到經 絲裂霉素處理的小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上培養箱中培養。

本發明的有益效果是：

通過慢病毒多次感染牛胎兒成纖維細胞后能夠簡單、高效、快速地引起細 胞發生誘變，誘變的細胞在形態和生長性能等方面呈現特征性變化，表現出一 定干細胞特征，牛體細胞病毒誘導方法誕生的誘變細胞將會作為一種新型的細 胞材料在牛的轉基因克隆、新品種培育、育種改良及細胞基因表達調控等方面 發揮重要的作用，同時，也為人類及其他物種的細胞提供借鑒和參考。

[附圖說明]

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

圖1是出現誘變的牛胎兒成纖維細胞的生長形態；

圖2是誘變形成的細胞集落在飼養層上的生長形態

[具體實施方式]

一、細胞培養和慢病毒感染

取懷孕2.5月齡牛的胎兒，采用組織塊培養法建立牛的胎兒成纖維細胞系。 磷酸鈣介導pLentilox3.7慢病毒表達載體及其包裝組分在293T細胞中包裝形 成慢病毒顆粒，12-16h后更換新鮮的高糖DMEM培養液，病毒包裝48h后收集 病毒液，經超濾濃縮后添加到牛胎兒成纖維細胞培養板內，細胞密度為 1.0×10⁴/cm²，每次病毒感染間隔24h，共計病毒液感染細胞4次，病毒感染2 次后更換含1000U/ml?LIF、4ng/ml?bFGF的高糖DMEM培養液，細胞形態出現集 落變化后，1mg/ml?Dispase消化后接種到經絲裂霉素處理的12.5d小鼠胎兒成 纖維細胞飼養層上培養箱中培養。

二、免疫熒光分析