[發(fā)明專利]基因突變和HIV-1耐藥突變位點檢測方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110285592.2
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102312004A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 張曉光;馬晶;曾毅
• 申請（專利權）人: 張曉光;曾毅
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京金闕華進專利事務所(普通合伙) 11224
• 代理人: 吳鴻維

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及PCR技術、反向雜交技術和單核苷酸延伸標記技術。

背景技術

據中國衛(wèi)生部統(tǒng)計結果，截至2010年，全國累計報告人獲得性免疫缺陷病毒(Human?Immunodeficiency?Virus，HIV)感染者和艾滋病(Acquired?Immunodeficiency?Syndrome，AIDS)病人約75萬例，全國每年有大量的艾滋病感染者接受免費高效聯(lián)合抗逆轉錄病毒(HighlyActive?Antiretroviral?Therapy，HAART)治療，HAART治療能夠有效控制病毒復制，延長患者的生命，大大地降低HIV/AIDS相關疾病的發(fā)病率和病死率。但是HIV耐藥性的出現(xiàn)卻極大地限制了抗病毒治療的效果。選擇一個能最大限度地抑制HIV-1復制的藥物治療方案已成為一個極具挑戰(zhàn)性的任務。因此，了解HIV感染者病毒耐藥變異情況，有針對性的選擇抗病毒藥物組合，成為艾滋病治療工作中的一個重要內容。

HIV-1逆轉錄酶的不忠實性復制會造成錯誤堿基的摻入，同時逆轉錄酶不具備校正功能，所以在病毒復制過程中會產生大量變異。據文獻報道，每天艾滋病人體內會產生大約10⁷～10⁸子代病毒，逆轉錄酶的錯配幾率約為3.4×10⁵/堿基。HIV基因全長約10kb，因此每天會產生10⁴～10⁵個單點突變。在數(shù)量眾多的突變中，對抗病毒藥物具有抵抗作用的基因突變株在藥物選擇壓力下逐漸成為優(yōu)勢病毒株，會導致病毒學治療失敗，進而發(fā)展成免疫學失敗，最終導致臨床失敗。研究證明，根據耐藥檢測結果選擇抗病毒治療方案可有效地降低病毒載量，升高CD4細胞含量，從而極大地改善HIV-1感染者抗病毒治療的效果。1999年耐藥性協(xié)作研究組(Resistance?Collaborative?Group，RCG)的一項用藥方案與病毒耐藥基因型表型之間關系的研究結果表明，有針對性的對基因型或表型預測失敗者更改用藥方案可以使治療失敗率降低30％～50％。因而在抗病毒治療的過程中對每一個患者進行耐藥突變檢測是提高治療效果、延長病人生命、降低發(fā)病率和病死率的重要手段。

目前HIV耐藥檢測方法主要有3種：基因型耐藥檢測(GART)、表型耐藥檢測(PART)和虛擬耐藥檢測(virtual?phenotype，vPT)。傳統(tǒng)的基因型耐藥檢測以核酸序列測定為基礎，首先通過RT-PCR擴增出HIV的蛋白酶和逆轉錄酶基因的核酸序列，然后與參比毒株的核酸序列比較了解耐藥位點是否發(fā)生變異。以RT-PCR擴增產物測序為基礎的檢測方法準確性高、信息全面，是HIV耐藥臨床檢測金標準。但是測序方法存在如下缺點：檢測靈敏度不高，一般要求檢測樣本病毒拷貝數(shù)＞1000cp/ml；分辨率低，不能檢出相對含量小于20％的病毒突變株；不能直接提供耐藥信息，且無法定量；由于耐藥位點變異多且較為分散，需要同時進行多個測試反應。HIV耐藥位點表型檢測首先需要對HIV感染者進行病毒分離培養(yǎng)，然后再進行藥物敏感實驗。近年來出現(xiàn)了利用重組病毒進行HIV-1表型耐藥檢測。該方法主要是將HIV感染者體內的病毒蛋白酶和逆轉錄酶基因插入載體，同時與骨架質粒共轉染細胞包裝重組病毒，應用重組病毒進行耐藥表型檢測。表型檢測具有如下優(yōu)點：可以對病毒耐藥情況進行定量分析；對B亞型和非B亞型均可進行分析；可以檢測病毒序列中所有突變的作用，結果易于解釋。但是表型檢測由于受到價格昂貴、周期長、生物安全級別要求高等缺點很難大范圍推廣使用。虛擬表型檢測首先需要建立基因型和表型之間的對應的數(shù)據庫，通過對比測序結果，在數(shù)據庫找出與感染者體內病毒序列相同或相似的序列，即可以給出藥物敏感的參考意見。虛擬表型分析的可靠性依賴于數(shù)據庫資料的準確性，要求隨時更新耐藥位點與表型之間的對應關系。但是虛擬表型檢測仍然需要進行序列測定，同樣受到基因型檢測適用范圍的限制。許多研究表明，各種表型耐藥檢測和基因型耐藥檢測的結果具有較高的一致性，并提出用基因型代替表型耐藥檢測。

無論是表型檢測還是基因型檢測目前只能在有條件的實驗室中小范圍使用，因此研發(fā)一種實驗周期短，準確性好，靈敏度高，同時能夠進行多位點檢測，價格便宜，能夠在基層醫(yī)療單位使用的耐藥檢測試劑在艾滋病防治工作中具有重要意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種可以同時檢測多個基因突變的方法和一種HIV-1耐藥突變位點基因檢測試劑盒。此方法整合了基因擴增、反向雜交和單核苷酸延伸標記技術。