[發(fā)明專利]一種新型腦腸肽激動劑分子的制備方法及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110285337.8
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102382191A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金堅;許正宏;竇文芳;陳蘊
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N1/19;C12N15/81;A61K38/38;A61K38/26;A61P3/10;C12R1/84
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技術(shù)領(lǐng)域

一種新型腦腸肽激動劑分子制備方法及其應用，屬于蛋白質(zhì)藥物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在人體內(nèi)，有些肽類在胃腸和神經(jīng)系統(tǒng)雙重分布，稱為腦腸肽(braingutpeptide)。腦腸肽不僅在外周廣泛地調(diào)節(jié)著胃腸道的各種功能，而且在中樞也參與對胃腸道生理活動的調(diào)節(jié)。

腦腸肽類蛋白質(zhì)可作為藥物用于治療多種疾病，如糖尿病等。藥代動力學研究表明，多肽/蛋白類藥物主要通過降解、排泄、以及受體介導的內(nèi)吞等作用在體內(nèi)被清除，其中分子量小于20kDa的多肽因子在代謝過程中易被腎小球濾過，通過腎小管時多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而多肽因子的半衰期短。為了達到治療效果，需要頻繁的大劑量用藥，長期的頻繁注射不僅增加了病人的痛苦和治療費用，而且易引發(fā)一系列嚴重的毒副作用。因此尋找新型長效的蛋白質(zhì)/肽分子一直是藥物鄰域研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型腦腸肽激動劑分子，其核苷酸序列如附圖1所示，簡稱GGH。

本發(fā)明的目的還在于提供一種GGH的制備方法。

本發(fā)明的目的還在于提供一種畢赤酵母高產(chǎn)菌株KM71(pPIC9K-GGH)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC?No.4892，保藏日期為2011年5月24日。

本發(fā)明的目的還在于提供一種畢赤酵母高產(chǎn)菌株KM71(pPIC9K-GGH)的制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本申請人做了如下工作。用生物信息學軟件InsightII、ICMpro、Amber計算得出新型腦腸肽激動劑分子的合理構(gòu)象，并完成了其與腦腸肽的分子對接，進一步利用PCR技術(shù)擴增了新型腦腸肽激動劑分子基因。首先利用DNA合成儀合成了將GLP-1的N末端第二位的丙氨酸突變?yōu)楦拾彼岬暮塑账嵝蛄?GLP-1_A2G)₂，然后選擇(GLP-1_A2G)₂作為目標分子與人白蛋白融合表達，即采用蛋白質(zhì)融合技術(shù)。利用白蛋白分子質(zhì)量大的性狀將藥物的易致機體產(chǎn)生過敏的部分包裹，使藥物蛋白的活性部分暴露。利用重疊PCR技術(shù)，在體外成功拼接(GLP-1_A2G)₂基因和HSA基因，得到融合基因(GLP-1_A2G)₂-HSA，簡稱GGH。

由于大腸桿菌表達系統(tǒng)的不足，本申請人還構(gòu)建了畢赤酵母高產(chǎn)菌株KM71(pPIC9K-GGH)，使GGH可以高效表達，并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)上的應用。本申請人將GGH與畢赤酵母的分泌型多拷貝質(zhì)粒pPIC9K連接，線性化之后通過電轉(zhuǎn)到畢赤酵母KM71中，通過G418篩選，經(jīng)G418抗性篩選得到能耐受3mg/mL?G418重組菌12株，耐受4mg/mLG418重組菌5株，進行甲醇誘導表達，篩選得到1株表達量高的重組菌KM71(pPIC9K-GGH)，表達量為162mg/L。

此外，申請人將獲得的GGH進行了一系列的小鼠實驗顯示了該目標蛋白的具有良好的生物活性和較長的半衰期。GGH在體外對胰島原代細胞有較好的刺激作用，在濃度45nmoL時增殖率為35.4％，與單體的GLP-1相差不大。在糖耐量實驗中，GGH可以較好的控制小鼠的血糖水平，并且在給藥72h后中、高劑量組仍然有生物活性，而單體的GLP-1在給藥4h后就檢測不到生物活性。

附圖說明

附圖1GGH融合基因序列

附圖2在含4mg/mLG418的MD平板上長出的菌落表達情況

附圖3PCR驗證pPIC9K-GGH的KM71陽性轉(zhuǎn)化子

附圖4GGH的Western?blot鑒定

附圖5GGH對胰島細胞的增殖作用

附圖6不同時間小鼠的血糖增量

附圖7GGH與其他類似物藥效比較

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1重組表達質(zhì)粒pPIC9K-GGH的構(gòu)建

本實施例中所使用的培養(yǎng)基配方如下：

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10mmol/L，pH?7.0。需要時使用前加入100μg/mL氨芐青霉素，固體培養(yǎng)基添加15g/L瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。