[發(fā)明專利]一種抑制蕓苔根腫菌的解淀粉芽胞桿菌及其活性物質(zhì)的分離與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110284741.3
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102382781A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設計）人: 劉曉艷;楊自文;王開梅;萬中義;閔勇;江愛兵;曹春霞;張志剛;周榮華
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/00;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/07
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

1.一種解淀粉芽胞桿菌，其特征在于命名解淀粉芽胞桿菌HB-26，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2011年7月18日，保藏中心編號CCTCC?NO.M2011259。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌，其特征在于菌體大小為0.4～1.0umx1.0～1.5um，細胞呈短桿狀，芽胞中生，革蘭氏染色呈陽性反應，能運動，在LB瓊脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落橢圓形、表面隆起有皺褶，最適生長溫度為30℃，pH6-8生長。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌，其特征在于菌體在pH7.0-7.2生長。

4.一種權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于具體步驟如下：

1)將沼液進行分離培養(yǎng)與保存

稱取0.1g土樣及1ml沼液，分別加入滅菌去離子水至總體積為10ml，混勻后再依次取1ml，繼續(xù)稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀釋后的菌液200μl涂布LB平板，30℃培養(yǎng)過夜，分別挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入5ml?LB液體培養(yǎng)基中，200rpm?30℃活化8-10h，用25％甘油保存在-80℃，

LB平板配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl?10g、瓊脂粉20g；補充水分至1L，pH?7.2，121℃滅菌30min；

2)細菌的小量發(fā)酵

將活化過夜的細菌單菌落按1％的接種量轉(zhuǎn)接于100ml?LB液體培養(yǎng)基中，200rpm30℃振蕩培養(yǎng)24-36h，

LB液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl?10g，補充水分1L，pH?7.2，121℃滅菌30min；

3)抑菌活性檢測的白菜根腫病盆栽實驗

(1)將大白菜種子用溫水浸泡過夜，用70％酒精洗一遍，點播在裝有培養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，每缽放2顆種子，在20℃溫室中避光培養(yǎng)14d，每天澆水一次，模擬自然條件培育；

(2)將生長至3-4葉片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分為混入蕓苔根腫菌的病土及沒有病原菌的健康土兩種，每個處理設置5次重復，20℃培養(yǎng)，每天澆水一次；

(3)每2個星期灌根一次，共灌根3次，每次用100ml步驟2)的菌液灌根，傍晚灌根；

(4)2個月后，將白菜根部拔出，根據(jù)沒有根腫的植株找出對應灌根所用的菌株，即為對根腫菌有抑菌活性的菌株。

5.一種從權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌分離對蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，其特征在于具體步驟如下：

1)HB-26菌株的發(fā)酵與活性物質(zhì)提取

LB液體培養(yǎng)基中接種HB-26，過夜培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)接至20L發(fā)酵罐中，進行12L?LB培養(yǎng)液的小量發(fā)酵，30℃培養(yǎng)，溶氧量20％-30％，通氣量1∶0.3-1∶0.5，轉(zhuǎn)速從200rpm-300rpm，pH?6.5-7.0，發(fā)酵24h后，取出發(fā)酵液，倒入凍干槽中，每槽狀菌液量為100ml，凍干機中凍干2-3天后，將凍干粉從凍干槽中取出裝入三角瓶中，每6個凍干槽的菌粉裝入1個三角瓶，每個三角瓶中加入100ml乙酸乙酯，混勻后室溫180rpm振蕩1h，取上清液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到干粉，加入100％甲醇溶解；

2)HB-26菌株活性物質(zhì)的分離

取5ml甲醇溶解的樣品進行HPLC分離，所用色譜柱為反相柱，10μm，10×250mm，進樣體積800μl，柱溫為25℃，流速7.5ml/min，流動相為乙腈和水，采用梯度洗脫，乙腈的濃度在25min內(nèi)5％變至100％，每分鐘收集一個組分，共收集到36個組分；

MS鑒定分離組分的分子量，質(zhì)譜檢測條件：電噴霧電離，毛細管電壓為3.5KV，錐孔電壓為45V，離子源溫度為100℃，干燥溫度為300℃，脫溶劑氣體流速500L/h，錐孔氣體流速為50L/h；

3)用盆栽實驗驗證活性成分，

盆栽實驗依然采用上述條件，每個處理設置兩棵植株，根據(jù)白菜根腫發(fā)作的情況，來判斷活性物質(zhì)為哪一個組分，結(jié)果顯示對白菜根腫病具有抑制效果的是組分17、20、30分鐘收集的組分。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從解淀粉芽胞桿菌分離對蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，其特征在于分離出的抑菌活性物質(zhì)命名為BA20，是糖類衍生物，分子量為1494.0。

7.一種由權(quán)利要求5所分離的對蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的用途，其特征在于用作制備防治白菜根腫病的微生物制劑。