[發明專利]pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒的構建方法

無效

• 申請號: 201110283350.X
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102399818A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 周亞峰;楊向軍;李紅霞;韓蓮花;蔣文平
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

技術領域

本發明屬于生物起搏技術領域，具體涉及一種pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒及其構建方法。?

背景技術

哺乳動物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCN1～HCN4。這四種異構體在心臟中均已發現，但不同種屬、不同心臟組織和發育不同階段這些異構體的表達存在差異：不同種屬成年動物竇房結均優勢表達HCN4，約占竇房結總體HCN的80％。在四種異構體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏細胞中有低水平表達。起搏活性小的區域(如心室肌)，HCN2的表達占優勢；而起搏活性高的區域HCN4的表達占優勢。目前對于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4，也就是把起搏基因HCN1-4轉到干細胞中，增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構建起搏通道基因亞型pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒是研究HCN4基因、起搏電流的特性以及研究生物起搏的前提和基礎。?

發明內容

本發明目的在于提供一種pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒的構建方法，使pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒中帶有HCN4基因，可以作為生物起搏研究的基礎，也可以作為慢性心律失常的細胞治療和基因治療的基礎。?

為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是：?

一種pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒的構建方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：?

(1)從心肌組織中提取總RNA，將提取的總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，以反轉錄得到的cDNA為模板，使用含有核苷酸序列為SEQ?No：2和為SEQ?No：3的基因特異性引物通過PCR擴增得到HCN4起搏基因；?

(2)抽提pCDH1-MCS1-EF1-copGFP質粒，分別對空質粒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP和步驟(1)PCR擴增得到的HCN4起搏基因用EcoR?I和BamH?I進行雙酶切：?

(3)將雙酶切后的空質粒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP和雙酶切后的HCN4起搏基因進行連接反應，將HCN4起搏基因連接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP質粒中，構建形成pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒。?

優選的，所述方法步驟(1)中從心肌組織中提取總RNA采用的提取試劑為Trizol試劑。?

優選的，所述方法步驟(1)中提取的總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈時先進行退火使RNA變性，然后在具有反轉錄酶的條件進行合成cDNA第一鏈。?

優選的，所述方法步驟(1)中進行PCR擴增的PCR反應體系包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的，所述PCR反應體系終濃度組成為：?

PCR緩沖液?????????終濃度1～10×；?

dNTPs?????????????0.01～1.5mM；?

基因特異性引物????終濃度為0.01～2μM；?

模板cDNA??????????0.01～10ng/μL；?

KOD?plus酶????????0.01～1.0U/μL；?

MgSO₄?????????????終濃度為0.5～5mM。?

優選的，所述方法步驟(1)中進行PCR擴增的條件為92～97℃預變性4～15min；92～97℃變性10～30s，56～60℃退火10～30s，65～75℃延伸10～30s，共30～40個循環。?

優選的，所述方法步驟(2)中采用堿裂解法小量抽提pCDH1-MCS1-EF1-copGFP質粒。?

優選的，所述方法步驟(2)中進行酶切的條件是溫度控制在32～38℃，酶切1～3小時。?

優選的，所述方法步驟(3)中進行連接反應的條件是溫度控制在20～25℃，連接反應進行1～3小時。?

本發明通過pCDH1-MCS1-EF1-copGFP基礎質粒作為表達載體與克隆HCN4基因(HCN4基因的序列SEQ?No：1)的cDNA結合構建成起搏通道?基因亞型pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質粒。?