[發(fā)明專利]攜帶雙篩選基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110283158.0
• 申請(qǐng)日: 2011-09-22
• 公開（公告）號(hào): CN103014055A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董小巖;田文洪;吳小兵;董哲岳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/79
• 分類號(hào): C12N15/79;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種攜帶dhfr和neo基因的真核表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr，該表達(dá)載體主要由AAV2的ITR、neo基因表達(dá)框、dhfr基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框組成，其中外源基因表達(dá)框中含有多克隆位點(diǎn)MCS，用于表達(dá)外源基因的插入。使用時(shí)將外源基因插入其表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)之間，獲得外源基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)細(xì)胞，多種策略篩選獲得外源基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。由于該載體攜帶AAV2的ITR序列，因此有利于外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得。同時(shí)，該載體包含兩種篩選基因，適用于多種表達(dá)細(xì)胞并縮短穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的篩選過程。本載體可高效地真核表達(dá)多種外源基因，為真核蛋白的表達(dá)提供了新的選擇。

背景

表達(dá)載體是一種將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并使宿主細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源基因的運(yùn)載工具。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同，表達(dá)載體可分為以大腸桿菌為主要宿主的原核表達(dá)載體和以酵母、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主的真核表達(dá)載體。所謂真核表達(dá)載體指的是將外源基因?qū)胝婧怂拗骷?xì)胞(如酵母、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的工具，而且其攜帶的結(jié)構(gòu)元件不僅直接影響外源基因的表達(dá)水平還影響外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得。為了實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)，真核表達(dá)載體通常具有以下基本元件：真核啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、加尾信號(hào)序列、真核篩選基因表達(dá)框以及原核復(fù)制子和篩選基因表達(dá)框，其中啟動(dòng)子調(diào)控外源基因的轉(zhuǎn)錄，多克隆位點(diǎn)用于外源基因的插入，真核篩選基因用于篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株，原核復(fù)制子和篩選基因則用于真核表達(dá)載體的構(gòu)建和擴(kuò)增。

在真核表達(dá)載體中，常用的真核啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子、小鼠巨細(xì)胞病毒(Mouse?cytomegalovirus，mCMV)啟動(dòng)子和猴空泡病毒40(Simian?virus?40，SV40)啟動(dòng)子等。這些啟動(dòng)子均具有很高的轉(zhuǎn)錄活性，有利于外源基因的高效表達(dá)。

利用真核篩選基因獲得外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，是蛋白表達(dá)過程中常用的一種策略。目前常用的真核篩選基因?yàn)椋簄eo(氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因、dhfr(二氫葉酸還原酶)基因、puro(嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因和Hyg(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因等。其基本原理是：當(dāng)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，用含有真核表達(dá)載體表達(dá)篩選基因的作用底物(該底物通常會(huì)抑制細(xì)胞株的生長(zhǎng)或?qū)е录?xì)胞死亡)的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)真核表達(dá)載體的細(xì)胞由于表達(dá)篩選基因而存活且生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)真核表達(dá)載體的細(xì)胞則生長(zhǎng)受到抑制或死亡。在實(shí)際操作中，獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株以后，因細(xì)胞株中不同細(xì)胞間外源基因表達(dá)水平差異，通常還需將細(xì)胞單克隆化，進(jìn)一步篩選獲得高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。

neo基因是一種常用的獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選基因，編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，其作用原理是氨基糖類抗生素G418通過影響核糖體80S亞基功能抑制蛋白質(zhì)合成，從而對(duì)真核細(xì)胞產(chǎn)生毒性，當(dāng)neo基因整合進(jìn)入細(xì)胞基因組后，穩(wěn)定表達(dá)氨基糖甘膦酸轉(zhuǎn)移酶，使G418磷酸化，導(dǎo)致其失活，細(xì)胞存活并生長(zhǎng)。neo基因作為一種選擇標(biāo)記基因，以廣泛地應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因細(xì)胞株的篩選。以neo基因?yàn)楹Y選基因且來源于ATCC(American?Tissue?Culture?Colection)的pSV2neo，作為一種經(jīng)典的表達(dá)載體，現(xiàn)在仍存在較為廣泛的應(yīng)用。