[發明專利]一種丙酸桿菌屬菌株質粒純化的方法

有效

• 申請號: 201110283128.X
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102321617A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;諸葛鑫
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種質粒的純化方法，特別是一種丙酸桿菌屬菌株質粒的純化方法。

背景技術

丙酸桿菌是一類革蘭氏陽性，不運動，不產芽孢，厭氧耐氧，過氧化氫酶陽性的桿狀細菌，并且細胞壁較普通的革蘭氏陽性菌成分更加復雜，結合更加緊密。丙酸桿菌是一類重要的工業用微生物，已經廣泛用于生產微生物B₁₂、四吡咯化合物和丙酸，并且也應用于面包、奶酪、藥劑的制作產業中。特別是丙酸，作為一種初級代謝產物，廣泛應用于纖維素膜、除草劑、香水中。丙酸同時也是一種抑菌劑，可用于食品和糧食的保藏。

典型的丙酸桿菌是一類非致病菌，是一類很具有吸引力的異源基因表達的宿主。雖然很多研究嘗試對丙酸桿菌進行突變，但是對于丙酸桿菌的基因工程操作才剛剛起步。丙酸桿菌基因工程操作的發展，將使異源基因和細菌素大量表達而用于食品工業。基因克隆將給丙酸桿菌的基因研究和維生素B₁₂、四吡咯化合物、卟啉化合物的生產帶來便利。

丙酸桿菌缺乏基因工程研究的原因主要有：高GC含量，缺乏質粒信息，缺乏合適的可用于轉化的質粒載體，丙酸桿菌存在的強限制性修飾作用和缺乏合適的抗性標記。

丙酸的生產方法主要是化學合成法，其主要原因是微生物發酵法生產成本較高，目前還無法和化學合成法競爭。要實現丙酸的發酵法生產以完全替代化學合成法，就必須大幅提高有機酸發酵生產的產量、生產強度和底物轉化率，這就要追根于菌體利用代謝途徑生產有機酸的關鍵科學問題。

丙酸生產代謝途徑中關鍵酶酶活力的限制、能荷水平的限制和分支代謝途徑的代謝流分流作用是普遍存在的關鍵科學問題。在丙酸代謝中，隨著代謝的進行，丙酸代謝途徑中的一些關鍵酶限制了由底物轉化為丙酸的速度，以及丙酸相關的代謝部分流向分支代謝途徑，最終導致目標產物的產量和生產強度較低，生產成本較高。如在丙酸代謝過程中，當培養基中碳源甘油濃度超過40g/L時，產酸丙酸桿菌合成丙酸的能力無法繼續升高，反而降低，表現為高濃度碳源對丙酸桿菌生長有抑制作用；分支代謝途徑的存在導致由碳源流向丙酸的代謝通量降低，產物乙酸的產量達2.56g/L。雖然通過分批補料控制甘油的濃度使丙酸產量上升，但明顯使發酵周期延長，生產成本增加，染菌機率增加，且無法有效降低分支代謝產物產量。

因此，如何有效地提高代謝途徑關鍵酶的酶活力、提高細胞的能量生成速率和切斷分支代謝途徑是提高有機酸生產效率的重要科學問題之一。這就必須牽涉到丙酸桿菌的基因改造問題上，而丙酸桿菌的基因改造的前提就是能找到一個合適的篩選方法，能夠從丙酸桿菌內篩選到內源性質粒進行分析改造，從而利用改造的載體系統，對丙酸桿菌進行合適的基因操作。丙酸桿菌作為革蘭氏陽性菌，本身細胞壁成分較普通的革蘭氏陽性菌更加復雜和緊密，因此普通破壁條件無法順利破除細胞壁。J.L.Johnson和C.S.Cummins研究了丙酸桿菌屬菌株細胞壁成分間的差異，證明丙酸桿菌屬的菌株確實存在較為復雜的細胞壁。其后鮮有報道丙酸桿菌的研究，P.Kiatpapan和Y.Murooka報道了一株適用于丙酸桿菌屬菌株的載體的構建，但是并未提及具體的質粒的篩選提取以及純化方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種專門針對于丙酸桿菌屬菌株的質粒篩選純化方法。優化了前處理酶的種類和處理時間，提高了提取效率。考察了凍融對質粒純化的影響，進一步優化了質粒純化的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：取一定體積的培養菌液離心處理后經SET洗脫液洗滌、溶液I、溶液II、堿裂解液III，其中在溶液I處理后添加一定當量的溶菌酶、變溶菌素、蛋白酶K提高處理效果，堿裂解液III處理后，通過常規的純化步驟，獲得高質量的質粒。其中，SET洗脫液最佳用量為1/20菌液體積；溶液I最佳用量為1/20菌液體積；蛋白酶K用量為2倍菌液體積；溶液II最佳用量為1/10菌液體積；堿裂解液III用量為1/13倍菌液體積；異丙醇的最佳用量3/20倍菌液體積。

本發明優化了前處理用酶的種類和處理時間以及考察了凍融條件對質粒純化的影響，大大提高了提取效率，本發明利用優化的前處理步驟，與常規方法相比大大提高了質粒的純度、濃度和穩定性。

附圖說明

圖1凍融不同條件對質粒純化的影響；

圖2質粒純化后核酸電泳圖譜；

圖3質粒純化后核酸電泳圖譜。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實例來進一步詳細說明本發明。

實施例1