[發明專利]利用天然油體重構法制備固定化脂肪酶用于生產生物柴油

無效

• 申請號: 201110283115.2
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102321693A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 白林含;張樹軍;白方文
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12N15/70;C12N11/02;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種以基因工程的方法表達脂肪酶，并使用天然油體作為固定化酶基質以制備固定化脂肪酶來生產生物柴油的方法。

背景技術

1.?生物酶法制備生物柴油的概況

生物酶法制備生物柴油是利用脂肪酶的酯化和轉酯反應活性，催化油脂和醇反應生成生物柴油。與物理法和化學法相比，用脂肪酶作催化劑制備生物柴油，具有應用范圍廣、原料選擇性較低、催化效率高、反應條件溫和及對環境友好、醇用量少、后處理簡單、無污染物排放、副產物甘油較易分離等優點。

目前，天然的脂肪酶作為催化劑來生產生物柴油存在著一定的局限性，主要有：(1)脂肪酶對低鏈醇的轉化率較低，致使脂肪酶用量過大、反應周期過長，脂肪酶的轉酯反應活性有待進一步提高；(2)短鏈醇特別是甲醇對脂肪酶有一定的毒性，酶的使用壽命縮短，生產成本過高，脂肪酶的甲醇耐受性也必須進一步改善。正是這些因素制約著酶法生產生物柴油的大規模應用。

固定化酶是在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續地進行反應，反應后的酶可以回收重復利用。將游離脂肪酶固定在載體上催化反應合成所需要的產物,使昂貴的脂肪酶得以重復使用,?降低了反應的成本。且固定化酶具有可以回收,?重復使用,?穩定性高,產品質量高等優點。因此，固定化脂肪酶應用前景被普遍看好。

2.?脂肪酶的固定化方法

?????當前固定化脂肪酶的方法很多,可概括為物理法、化學法及生物法。由于載體材料、制備方法及固定酶的來源等不同，導致制備固定化酶的難易程度、固定效果、酶的穩定性等也有所不同。

????物理方法，包括吸附法和包埋法。吸附法是通過物理吸附將酶固定于纖維載體的一種固定化方法。?物理吸附法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結構變化少的優點，另外，吸附過程可以同時達到純化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生。因而酶活力損失較少，若能找到適當的載體，這是很好的方法。包埋法是將酶物理包埋于多聚物內以達到固定化的目的。包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進行結合反應，很少改變酶的高級結構，因此酶活回收率較高。但是在包埋時發生化學聚合反應，酶容易失活，必須巧妙設計反應條件，使之化學反應時不至于破壞酶的活性部位和活性中心。

北京化工大學研究者將自有菌株發酵提取的脂肪酶(Candida?sp.?99-125)用硅藻固定,采用酯化法直接將脂肪酸與甲醇反應,油酸和甲醇摩爾比為1∶1.4?,反應過程中加入硅膠作吸水劑,反應24h?,酯化率可達92％。Yomi?Watanabe等人運用固定的假絲酵母（Candida?antarctica）脂肪酶催化豆油與甲醇反應中獲得了93.8％的轉酯率，并且其固定化酶循環25次之后活性沒有發生任何改變。官春云等用硅藻土對實驗室篩選得到的成團腸桿菌脂肪酶干燥酶粉進行固定化，轉酯率達到91.03%。

化學法主要是采用共價結合法。該方法是通過酶分子之間或酶蛋白分子的功能團與載體表面上的反應基團之間以共價鍵相互連接，形成固定化酶。羅文等以多孔玻璃為載體，采用共價法對假絲酵母99-125脂肪酶進行了固定，并以所制備的固定化酶為催化劑，在溫水體系中利用菜籽油合成生物柴油，采用3次流加甲醇的方式在石油醚中合成生物柴油，每一批次反應后過濾出固定化酶，用叔丁醇清洗后繼續進行下一批次的反應，固定化酶連續反應13批(每批30?h)后，生物柴油反應轉化率仍維持在70%以上。固定化脂肪酶的半衰期在390?h以上。