[發明專利]一種快速檢測樣品中大腸埃希桿菌O157∶H7的試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201110282719.5
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102435745A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 王利兵;胥傳來;勇倩倩
• 申請（專利權）人: 王利兵;胥傳來;勇倩倩
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種大腸埃希桿菌O157∶H7的雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于利用加熱滅活的大腸埃希桿菌O157∶H7免疫原免疫健康的新西蘭大白兔得到多克隆抗體作為包被抗體，免疫BALB/C小鼠并進行細胞融合得到單克隆抗體作為二抗，建立了大腸埃希桿菌O157∶H7的雙抗夾心酶聯免疫法的試劑盒；大腸埃希桿菌O157∶H7即ATCC?35150，所述試劑盒由以下幾部分組成：

（1）反應板：以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋的多克隆抗體，包被96孔酶標板，每孔100μL；4℃孵育過夜，按照常規ELISA方法封閉洗滌，為試劑盒中的反應板；

（2）大腸埃希桿菌O157∶H7陽性對照標準品；陰性對照標準品；

大腸埃希桿菌O157∶H7接種在山梨醇麥康凱SMAC平板上，37℃培養24h，挑取單菌落接種于改良E.C新生霉素增菌肉湯37℃、200r/min振蕩培養17h，計數，沸水浴加熱1夜滅活，生理鹽水調整大腸埃希桿菌O157∶H7濃度至5×10⁹cfu/mL，為免疫原；

用滅菌PBS緩沖液調整大腸埃希桿菌O157∶H7濃度為10⁷cfu/mL為陽性對照標準品，滅菌PBS緩沖液為陰性對照標準品；

（3）以抗體稀釋液稀釋的單克隆抗體抗血清；

抗體稀釋液：含0.1%明膠的PBST溶液；

（4）酶標二抗：以抗體稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠GAM-HRP；

（5）顯色液A：0.933?g檸檬酸，3.68?g?Na₂HPO₄·12H₂O，18?μL?30%H₂O₂用超純水定容至100?mL；

顯色液B：60?mg?3,3^/,5,5^/-四甲基聯苯胺TMB溶于100?mL乙二醇中；

使用前將A與B以5:1體積混合；

（6）終止液：2M?硫酸溶液。

2.權利要求1所述的大腸埃希桿菌O157∶H7的雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于步驟（1）中以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋的多克隆抗體，稀釋至多克隆抗體濃度為3μg/mL；步驟（3）中以抗體稀釋液稀釋的單克隆抗體抗血清，稀釋至單克隆抗體濃度為1μg/mL。

3.權利要求1所述的大腸埃希桿菌O157∶H7的雙抗夾心酶聯免疫檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟如下：

預先配制PBST溶液：pH7.4、0.01mol/L?PBS溶液中含0.15mo1/L?NaCl及0.5%?Tween-20；

a、分別在反應板內加入待測樣品、陽性對照標準品、陰性對照標準品，100μL?/孔，于37℃溫育1h；

b、洗滌：用PBST洗滌反應板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反應板；

c、加入以抗體稀釋液稀釋的單克隆抗體抗血清，100μL/孔，37℃反應1h；

d、洗滌：用PBST洗滌反應板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反應板；

e、加酶標二抗：GAM-HRP，100μL?/孔，37?C反應1h；

f、洗滌：用PBST洗滌反應板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反應板；

g、顯色：加顯色液?100μL?/孔，避光顯色15min；

h、終止：加終止液100μL?/孔；

i、測定：用酶標儀450nm測吸光值OD，即吸光值A450；

當[(樣品的吸光值A450)/(陰性標準品吸光值A450)]＞2.1，且[(陽性標準品吸光值A450)/(陰性標準品吸光值A450)]＞2.1時，待測樣品呈陽性；

當[(樣品的吸光值A450)/(陰性標準品吸光值A450)]＜2.1，且[(陽性標準品吸光值A450)/(陰性標準品吸光值A450)]＞2.1時，待測樣品呈陰性。