[發(fā)明專利]一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻1的引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110282188.X
• 申請日: 2011-09-21
• 公開（公告）號: CN103014133A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金蕪軍;宛煜嵩;苗朝華;張秀杰;于曉芹
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻1的引物。

背景技術(shù)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是食品、農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是開展轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的基準(zhǔn)物。開發(fā)轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對原材料的均勻性、穩(wěn)定性、特征量值范圍等方面有嚴(yán)格要求。目前，國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因成分檢測普遍采用基于核酸的定性、定量檢測方法。其中定量檢測通常采用RealTime-PCR方法對樣品中靶標(biāo)核酸序列進(jìn)行絕對定量，即測定外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)，并以此為基礎(chǔ)計(jì)算樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。在轉(zhuǎn)基因成分檢測中，可以將外源DNA看作一個(gè)基因座位，一個(gè)純合體的2倍體基因組中檢測靶標(biāo)核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為2，一個(gè)雜合體的2倍體基因組中外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為1，非轉(zhuǎn)基因材料中則為0。因而，轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備原材料的均勻性、穩(wěn)定性、特征量值范圍，主要體現(xiàn)在外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列的雜合或純合狀態(tài)。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程中，必需對原材料中靶標(biāo)核酸序列的遺傳特性進(jìn)行確認(rèn)，即確認(rèn)外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列是純合還是雜合狀態(tài)。

目前，已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，主要包括針對外源目的基因、調(diào)控元件的篩選檢測和基因特異性檢測，針對遺傳轉(zhuǎn)化載體的特征建立特異性檢測，針對外源DNA插入特征序列的品系特異性檢測等三類。利用以上方法，只能確定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分或含有何種轉(zhuǎn)基因成分，但無法直接鑒別樣品中外源DNA插入的純合或雜合狀態(tài)。國內(nèi)外目前還沒有針對轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻1(KMD1)外源基因純合/雜合狀態(tài)檢測方法的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻1(KMD1)的引物。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻KMD1的引物，包括：正向引物5′-GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3′和反向引物5′CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3′。該引物對是根據(jù)轉(zhuǎn)基因克螟稻1在轉(zhuǎn)基因過程中導(dǎo)致水稻基因組缺失的序列(Seq?ID?No.1)而設(shè)計(jì)的引物，利用該對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以純合外源基因KMD1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒有擴(kuò)增片段，以雜合外源基因KMD1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以擴(kuò)增出一條片段(209bp)。

本發(fā)明提供一種鑒定純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻1的方法，包括步驟：1)提取植物基因組；2)以步驟1)的基因組為模板，利用上述特異性引物進(jìn)行PCR檢測。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)選為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃5min。

PCR反應(yīng)體系優(yōu)選為：

本發(fā)明進(jìn)一步提供含有上述特異性引物的檢測試劑盒及其在檢測純合型轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻KMD1中的應(yīng)用。

本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因克螟稻1在轉(zhuǎn)基因過程中導(dǎo)致水稻基因組缺失的序列(Seq?ID?No.1)設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增，可以快速區(qū)分KMD1純合體和雜合體。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻1(KMD1)的外源基因純合的鑒定方法，可用于轉(zhuǎn)基因檢測用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的篩選鑒定。此外，在轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種過程中，需要將轉(zhuǎn)基因材料與其它材料進(jìn)行雜交、轉(zhuǎn)育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學(xué)手段快速、簡便鑒定純合體/雜合體育種材料，有利于縮短育種進(jìn)程。

附圖說明

圖1為本發(fā)明通過PCR反應(yīng)在水稻中的擴(kuò)增結(jié)果；其中，M：100bp?DNA?ladder；1：空白對照；2：外源基因純合的KMD1；3：外源基因雜合的KMD1。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊》(New?York：Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，2001)中所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑和材料均為市售商品。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻KMD1和非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63可市售獲得。

實(shí)施例

利用引物，其中正向引物為kmd1PD-F：

5′-GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3′，反向引物為kmd1PD-R：